乙型肝炎病毒X蛋白在体外和体内对SMMC7721细胞生长与分化的影响

【关键词】癌，肝细胞； 细胞分化； 乙型肝炎病毒X蛋白

Effects of HBx protein on the proliferation and differentiation of SMMC-7721 liver cancer cell in vitro and in vivo    YANG Shi-zhong, CHEN Gen, ZHANG Lei-da, ZHANG Ai-qun, XIONG Yan, ZHU Jin, LI Xiao-wu, DONG Jia-hong.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Cell differentiation; HBx protein

【First author’s address】Hospital of Hepatobiliary Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Corresponding author: DONG Jia-hong, Email: dongjh301@ 163.com

近年来，HBV对肝癌细胞生物学行为的影响受到越来越多的关注。我们前期研究结果表明乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）可以诱导肝癌细胞株SMMC-7721发生上皮-间质样表型转化（EMT），并显著增强肝癌细胞侵袭转移潜能[1]。鉴于肿瘤的恶性表型往往与肿瘤细胞的异常增殖和分化存在密切联系，为更加全面认识HBx蛋白对肝癌细胞生物学行为的影响，本研究中我们首先对SMMC-7721细胞进行HBx基因转染，然后通过体外和体内实验系统评价了HBx蛋白对肝癌细胞生长与分化的影响。

一、材料与方法

1. 质粒、细胞株、菌株及主要试剂：含有目的基因HBx的pcDNA3.1(-)-HBx由香港大学David Chan博士惠赠; 大肠埃希菌DH5α、BJ5183、pAdTrack-CMV (含绿色荧光蛋白，GFP)以及包装细胞293N均为解放军总医院肝胆外科医院实验室保存。SMMC-7721肝癌细胞株购自中国科学院细胞库。限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ及PCR试剂盒购自中国TaKaRa公司；Lipofectamin2000购自上海Invitrogen公司；HBx单克隆抗体购自美国USBiological公司；PV9000免疫组织化学检测试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司。

2. 构建含HBx基因的腺病毒载体并转染靶细胞：通过pcDNA3.1(-)-HBx质粒酶切获得HBx基因（530bp），克隆至pAdTrack-CMV，并电转化至包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183菌，得到含HBx基因的重组腺病毒质粒。按照Lipofectamine2000说明书转染包装细胞，24h后在荧光显微镜下观察GFP表达，冻融法获得病毒，CsCl梯度离心法纯化病毒。用制备的重组腺病毒感染肝癌细胞SMMC-7721，并确定感染效率。

3. 实验分组：以HBx基因转染细胞为实验组，以空载体转染细胞为阴性对照组，以未转染的SMMC-7721母细胞为空白对照组。

4. HBx基因在肝癌细胞SMMC-7721中的表达：提取转染后SMMC-7721细胞的总RNA，进行逆转录，并以逆转录产物为模板进行PCR。PCR上游引物为5′-GCACCTCTC TTTACGCGGACT-3′，下游引物为5′-TACAAAGACCT TTAATCTAATC-3′。PCR条件：94℃ 2min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。反应产物246bp，通过20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

5. HBx蛋白在肝癌细胞SMMC-7721中的表达：将腺病毒转染的SMMC-7721细胞爬片，用4℃丙酮固定10min；滴加HBx抗体（1∶100），在37℃湿盒中温育2h；其余染色步骤按PV9000试剂盒说明书进行，DAB染色3min。免疫细胞化学阳性信号为棕黄色细小颗粒状染色。

6. 细胞生长曲线及倍增时间测定：取生长状态良好的转染细胞，加入24孔板培养，每孔内细胞密度为1×104个/ml；每24h消化3孔细胞计数，取平均值，连续计数8d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线，并计算细胞倍增时间。

7. 平板克隆形成实验：取对数生长期转染细胞，按2000个/孔细胞接种于6孔板，每组细胞设3个复孔，在37℃、5% CO2条件下培养10d；经甲醇固定，姬姆萨染色，计数>50个细胞的克隆数。克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%。

8. 四甲基偶氮唑盐（MTT）实验：转染细胞培养于96孔板中，每孔1×104个细胞，贴壁后24h加入MTT，作用4h后弃培养液；加入100μl二甲基亚砜，振荡充分溶解5min，在酶标仪上测定570nm波长处的吸光度值。

9. 体内成瘤实验：健康纯种无特殊病原级BALB/C 4周龄雄性裸鼠30只（购自上海斯莱克实验动物有限公司），体质量（18±3）g，随机分为实验组和阴性与空白对照组，各10只。转染细胞计数、重悬、摇匀后，每只裸鼠双侧下肢髋关节上方皮下分别接种2.5×107个/ml的细胞悬液0.2ml。隔日测量肿瘤大小，计算肿瘤体积（V）：V＝L×S2×0.5 (L：肿瘤长径；S：肿瘤短径)[2]。观察肿瘤生长情况，在第28天时断颈处死裸鼠并测量皮下移植瘤长径和短径、秤瘤质量、做病理学分析。

10. 统计学分析：结果用均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS10.0软件对组间进行单因素方差分析。

二、结果

1. HBx重组腺病毒载体的构建、包装、纯化与滴度测定：pcDNA3.1(-)-HBx质粒经酶切反应，琼脂糖凝胶电泳可见246bp的目的基因HBx片段。基因测序提示目的基因HBx符合HBV-ayw亚型。重组腺病毒质粒转染包装细胞293N 24～48h后在荧光显微镜下可观察到GFP表达，病毒滴度测定为7.5×109pfu/ml。

2. HBx基因与蛋白在SMMC-7721细胞中的表达：重组HBx腺病毒感染SMMC-7721后，在荧光显微镜下看到GFP表达；RT-PCR检测到HBx mRNA表达；免疫细胞化学法检测到HBx蛋白在实验组肝癌细胞表达（图略）。

3. 细胞形态学改变：转染空载体对照组的细胞形态与母细胞相似，呈上皮细胞样高分化；含HBx基因的实验组细胞则逐渐转化为梭形，呈间质细胞样低分化。

4. 细胞生长曲线和倍增时间测定：转染HBx基因的实验组细胞增殖能力明显提高，生长曲线在第三天开始显著左移。实验组细胞、阴性对照组细胞和空白对照组细胞的倍增时间分别为30、36h和35h，转染HBx基因的实验组细胞倍增时间显著缩短。

5. 平板克隆形成实验：转染HBx基因的实验组细胞较阴性对照组和空白对照组细胞生长速度加快，集落形成大。三组细胞的平板克隆形成率分别为13.58%±0.36%、8.02%±0.49%和8.97%±0.41%，实验组与对照组之间差异有统计学意义（F＝194.954，P<0.01）。

6. 细胞增殖能力检测：MTT检测结果显示实验组细胞和阴性对照组细胞与空白对照组细胞的A570值分别是2.138±0.031、1.215±0.027和1.320±0.019，实验组细胞显著高于两组对照组细胞（F＝178.037，P<0.01）。

7. 肝癌细胞裸鼠皮下接种结果：实验组和对照组细胞成瘤率均为100％（图略）。在接种4周后处死裸鼠，实验组和阴性对照组与空白对照组裸鼠皮下肿瘤的体积分别是（542.4±183.3）mm3、（344.0±154.8）mm3、（365.0±161.5）mm3，三组间差异有统计学意义（F＝11.179，P<0.01）；三组裸鼠皮下瘤质量分别是（0.6582±0.2252）g、（0.4206±0.1953）g、（0.4513±0.1985）g，三组间差异有统计学意义（F＝8.828，P<0.01）。

8. 病理学观察：肿瘤标本固定并切片，HE染色后在光学显微镜下观察，实验组细胞分化程度低，细胞呈短梭形，细胞间隙明显，核质比例高；两对照组细胞分化程度高，细胞呈圆形，细胞间隙不清晰，细胞质丰富，核仁清晰。

三、讨论

HBx蛋白在人肝细胞癌组织中的阳性率达到71.8%，有强大的恶性转化能力，它可促进肝细胞癌发生，并增加其恶性表型，甚至诱导肝癌细胞发生上皮-间质样转化[1，3-4]。

肿瘤细胞的增殖和分化能力是评价其恶性程度的重要指标。本研究结果显示，实验组细胞生长曲线左移，细胞倍增时间缩短，而且实验组肝癌细胞克隆形成率高于对照组，表明转染HBx基因后明显提高了SMMC-7721细胞的增殖能力。通过裸鼠皮下接种实验进一步证实了上述结果。本研究结果还显示，HBx蛋白对肝癌细胞SMMC-7721分化具有重要影响。转染HBx基因后的实验组细胞呈现间质样低分化表型，大体观察还发现转染HBx基因后的裸鼠皮下移植瘤具有分叶生长的趋势，病理切片进一步显示其分化程度较对照组细胞低，这些都表明转染HBx基因后肿瘤细胞的分化程度降低，恶性程度增加。HBx蛋白是一种反式激活因子，理论上可以通过反式激活作用激活c-myc、c-fos、c-jun、c-Src原癌基因等多种途径影响肝（癌）细胞的增殖和分化[5-6]。

参  考  文  献

[1]Yang SZ, Zhang LD, Zhang Y, et al. HBx protein induces EMT through c-Src activation in SMMC-7721 hepatoma cell line. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 382: 555-560.

[2]Li L,Wu PH, Huang JL, et al. Inhibitive effects of recombinant adenovirus-mediated human endostatin on the growth of human hepatocellular carcinoma xenograft in nude mice. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2003, 11: 542-545. (in Chinese)

李立,吴沛宏,黄嘉凌,等.重组人内皮抑素腺病毒抑制肝癌裸鼠移植瘤生长.中华肝脏病杂志,2003，11:542-545.

[3]Chan CF, Yau TO, Jin DY, et al. Evaluation of nuclear factor-kappaB, urokinase-type plasminogen activator, and HBx and their clinicopathological significance in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 2004, 10(12 Pt 1): 4140-4149.

[4]Wang Y, Cui F, Lv Y, et al. HBsAg and HBx knocked into the p21 locus causes hepatocellular carcinoma in mice. Hepatology, 2004, 39: 318-324.

[5]Madden CR, Slagle BL. Stimulation of cellular proliferation by hepatitis B virus X protein. Dis Markers, 2001, 17: 153-157.

[6]Bouchard M, Giannakopoulos S, Wang EH, et al. Hepatitis B virus HBx protein activation of cyclin A-cyclin-dependent kinase 2 complexes and G1 transit via a Src kinase pathway.J Virol, 2001, 75:4247-4257.

（收稿日期：2010-04-02）

（本文编辑：朱红梅）

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