37nm非计量点氧化铁颗粒致HepG2细胞凋亡的研究

【关键词】癌，肝细胞； 细胞凋亡； HepG2细胞； 磁性纳米非计量点氧化铁颗粒

Effects of low frequency magnetic field on the apoptosis of HepG2 cells treated with FeOx nanoparticles   JU Hui-xiang, DAI Zhen-yu, SUN Ming-zhong.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular;  Apoptosis;  HepG2 cells;  FeOx nanoparticle

【First author’s address】Department of Clinical Laboratory, Affiliated Yancheng the Third Hospital, Southeast University School of Medicin, Yancheng Jiangsu 224001, China

Corresponding author: JU Hui-xiang, Email: jhx8386266@ yahoo.com.cn

本研究以肝癌细胞HepG2细胞为对象，观察37nm粒径磁性纳米非计量点氧化铁颗粒（FeOx）在外加磁场作用下对其增殖、凋亡的影响，旨在为FeOx用于治疗肝癌提供理论依据。

一、材料与方法

1．主要试剂及仪器：HepG2细胞购自中国科学院上海细胞库，人胎肝细胞（FHCs）购自美国Sciencell公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司，流式细胞仪购自美国BD公司。胰蛋白酶、1640培养基、胎牛血清（FBS），二甲基亚砜购自美国Sigma公司。CCK-8试剂盒购自日本同仁化学品公司，细胞凋亡及周期试剂盒购自美国BD公司，Western blot试剂盒购自英国ABCam公司。TYU-2002H Ⅱ型特斯拉计/高斯计购自上海亨通磁电科技有限公司。扫描电镜型号为日本HITACHI-X650，X-射线衍射仪型号为荷兰Philips X’pert XRD system型。

2．磁性纳米FeOx的制备、表征及细胞吸附：磁性纳米FeOx颗粒合成及表征参照文献[1]方法。纳米粒子合成后将37nm粒径纳米FeOx加入到细胞培养瓶中与细胞共同培养。纳米粒子吸附细胞方法为：将细胞消化成细胞悬液并调整细胞浓度大于105个/ml，再将不同粒径纳米粒子加入到细胞悬液中并在恒温摇床中匀速振荡30min，摇床摇速为200r/min。振荡完成后将细胞置于细胞培养箱中培养。细胞培养2d后经扫描电镜实验确定磁性纳米FeOx结合效率。

3．HepG2细胞培养：分别种植到含10% FBS的1640培养基的培养瓶，放置在37℃、5% CO2培养箱持续培养。FHCs细胞用专用培养基进行培养。细胞传代时用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，磷酸盐缓冲液（PBS）1500r/min离心15min洗涤2次，用含10% FBS的1640培养基重悬细胞后种植细胞，每次细胞种植浓度应大于105个/ml。人胎细胞临时保存在-70℃超低温冰箱，永久保存在液氮罐中。

4．100Hz交变磁场照射细胞：将细胞培养瓶置于离工作线圈顶端2cm，经特斯拉计测量磁感应强度为0.67mT，每间隔4h照射1次，每次照射30min。照射完成后，细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液进行各种检测。

5．细胞增殖实验：按试剂盒提供实验方法进行。首先取出96孔酶标板，依照次序对应分别加入50μl的标准品于酶标板微孔中，分别标记样品编号，将50μl细胞培养悬液（2.5×104个/ml）加入到酶标板中；在标准孔和样品孔中加入100μl的酶标记液，36℃孵育1h，将溶液倾出，PBS清洗5次后每孔加入底物A、B液各50μl，36℃下避光孵育反应15min后加入终止液50μl，终止反应。吸光度测试所用入射光波长为450nm。每隔12h重复进行以上步骤，72h得到细胞增殖数据绘制细胞增殖曲线。

6．细胞凋亡、死亡及周期实验：细胞凋亡及周期实验均在流式细胞仪上完成，均按试剂盒提供实验方法进行。凋亡实验方法为：将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用PBS洗涤2次，将细胞浓度重悬浓度调整为106个/ml。染色过程为首先用微量移液枪移取20μl细胞悬液，然后用Annexin-V加入到细胞悬液中并避光静置15min后将碘化丙啶染料加入并静置30min，染色完成后上机实验。细胞周期实验方法为：首先按凋亡实验相同方法处理细胞以待上机检测，染色方法为将试剂盒内A、B、C、D 4种试剂按顺序分别加入到细胞悬液中，避光静置时间均为15min。染色完成后上机实验。流式细胞仪实验条件为：细胞进样流速为中等速度，前向角补偿电势为56V。

7．细胞凋亡蛋白表达：收集细胞，PBS洗涤细胞2次，加细胞裂解液，超声破碎细胞。用抗凋亡抗体在4℃孵育肝细胞溶胞产物1h，孵育在含牛血清白蛋白、吐温浓度均为0.1%的PBS中进行。用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳提取凋亡蛋白，并通过电转移使之转录到聚二氟乙烯撑体中。运用强化化学发光法Western blot检验系统检测免疫复合物。

8．统计学分析：用SPSS13.0软件进行数据处理，实验结果用均数±标准差（x-±s）表示，采用两因素析因设计资料的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. 37nm FeOx吸附细胞实验结果：纳米FeOx颗粒均在细胞表面发生吸附，纳米粒子在HepG2细胞表面的吸附率为35%，在FHCs的吸附率为12%，表明纳米粒子更易在HepG2细胞表面发生吸附，由于HepG2细胞具有更大的表面积，纳米粒子在其表面吸附率更高,见图1。 

2. 细胞增殖实验结果：在未经磁场照射时，37nm FeOx吸附的细胞增殖抑制率均低于0.8%，表明纳米粒子的吸附对细胞增殖无明显影响。经极低交变磁场（EMF）照射后，37nm FeOx粒子吸附的细胞增殖被抑制，而且随着照射时间的延长，细胞增殖的抑制率逐渐增高，当EMF照射时间为300min时细胞增殖抑制率达到最大，此时37nm FeOx吸附HepG2细胞抑制率达到35.5%±3.2%，37nm FeOx吸附FHCs细胞抑制率为19.5%±1.2%，F＝15.32，P＜0.01，差异有统计学意义。

3．细胞凋亡和死亡实验结果：两种细胞自然生长300min时，37nm FeOx吸附HepG2细胞和FHCs，细胞凋亡率分别为0.01%±0.04%和0.01%±0.05%，死亡率分别为7.22%±0.17%、7.24±0.17%，差异无统计学意义，说明未经磁场照射的纳米粒子不能导致细胞凋亡。然而随着EMF照射时间的延长，细胞凋亡率随之增加，当EMF照射达到300min时，37nm FeOx吸附HepG2细胞的凋亡率为18.6%±6.7%，死亡率为17.4%±3.1%。37nm FeOx吸附FHCs细胞的凋亡率为6.6%±2.7%，死亡率为9.4%±3.1%，F＝27.36，P＜0.01，差异有统计学意义。当照射时间超过300min后，细胞凋亡率增速变慢。

4. 细胞周期实验结果：未经磁场照射时，37nm FeOx吸附HepG2及FHCs自然生长细胞周期比较无明显差异，与凋亡实验结果相符，表明FeOx吸附细胞并不能影响细胞周期。在外加EMF作用下，37nm FeOx吸附细胞DNA代谢均发生明显变化，细胞周期中G0/G1值增加。当EMF照射300min时，37nm粒子吸附HepG2，细胞增殖明显被抑制，而37nm粒子吸附FHCs，细胞增殖未受明显的影响，见表1。

5．细胞凋亡相关Bcl蛋白组表达结果：HepG2、FHCs细胞吸附纳米粒子后经EMF照射后，Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白均大量表达。纳米FeOx吸附HepG2组中当EMF照射时间达到300min时Bcl-2和Bax的表达量灰度值分别为25.4±2.5和72.4±3.7，FHCs组中分别为170.6±5.8和52.7±1.7。HepG2细胞组中Bcl-2、Bax的表达量灰度值较FHCs组较小，F＝89.5，P＜0.01，差异有统计学意义，表明HepG2细胞发生大量凋亡，而FHCs组中细胞凋亡抑制基因的大量表达起到了保护细胞的作用，其凋亡率与HepG2细胞组比较，与凋亡实验结果吻合。表明纳米粒子吸附细胞并不能改变细胞Bcl蛋白表达，但当有外加磁场作用时，其蛋白表达发生明显改变，见图2，3。

三、讨论

本研究小组已报道37nm FeOx在EMF照射下能较好的抑制肝癌细胞Bel-7402的增殖并导致细胞发生大量的早期凋亡[2]。本研究即以37nm粒径纳米FeOx颗粒在外加EMF作用下对不同种类肝脏细胞的凋亡影响为主要研究对象。

细胞增殖实验结果显示纳米FeOx在未有外加交变磁场作用时并不能影响细胞的正常分裂与增殖，HepG2与FHCs细胞增殖均未发生明显改变。而FeOx吸附两种细胞在EMF照射条件下，细胞增殖被抑制纳米粒子对癌细胞的抑制效果更为明显。同时，细胞周期实验结果显示大部分癌细胞被阻滞在G0/G1期，同时处于S期的细胞含量减少，表现为明显的S期和G2期阻滞。而正常肝脏细胞周期并未表现出明显的周期紊乱与细胞增殖实验结果吻合。

有研究表明，EMF照射细胞能影响细胞的增殖、导致细胞早期凋亡以及细胞DNA代谢发生紊乱和DNA双链断裂。而EMF照射纳米粒子吸附后细胞此种作用条件下这种影响更为明显。经流式细胞仪检测得到肝癌细胞凋亡率达到18.34%±3.69%，而正常肝癌细胞凋亡率仅为6.34%±2.67%，纳米FeOx在EMF作用下对肝癌细胞凋亡的影响更为显著。细胞凋亡相关蛋白实验结果表明，纳米粒子吸附细胞在EMF作用下，HepG2细胞Bax蛋白表达明显提高，此蛋白大量表达表明细胞发生大量凋亡，实验结果与流式细胞仪实验结果吻合。而FHCs细胞蛋白表达未提高，表明在此条件下细胞未发生大量凋亡。

纳米FeOx吸附HepG2细胞在EMF照射条件下，细胞膜表面电势被影响，Bax蛋白大量表达表明细胞癌细胞发生大量早期凋亡而Bcl-2蛋白表达虽然增加但其对细胞的保护作用被抑制，细胞发生大量早期凋亡；而FHCs细胞中Bcl-2蛋白表达明显高于Bax表达，表明FHCs细胞的自我保护作用更强，其凋亡率较低。其原因可能为纳米FeOx吸附细胞后在EMF照射条件下能导致细胞膜表面氧化物电势升高，从而导致细胞发生了大量早期凋亡。

37nm FeOx在EMF照射条件下能很好的抑制癌细胞的增殖，导致其发生大量凋亡，而正常细胞对照组并未产生明显的影响，37nm FeOx颗粒在EMF照射下对肝癌有一定的治疗效果。

参  考  文  献

[1]Suh WH, Suslick KS, Stucky GD, et al. Nanotechnology, nanotoxicology, and neuroscience. Prog Neurobiol, 2009, 87: 133-170.

[2]Ju HX, Dai ZY, Sun MZ, et al. Effects on different diameter of nano-FeOx powders under external magnetic field on characteristics of heptoma-cell lines Bel-7402. Jiangsu Daxue Xuebao(Yixueban), 2009, 19: 296-301. (in Chinese)

居会祥,戴真煜,孙明忠,等.不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞生物学特性的影响.江苏大学学报(医学版)，2009,19:296-301.

（收稿日期：2009-12-18）

（本文编辑：袁平戈）

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