基于核酶自剪切机制稳定分泌丙型肝炎病毒的细胞模型

【摘要】目的  利用核酶自剪切机制建立稳定分泌HCV的细胞膜型。 方法  以HCV感染性克隆的全基因组cDNA重组质粒为基础，在基因组两侧引入核酶序列，构建重组质粒pJFH1-核酶，并转染入HepG2细胞，加入G418溶液筛选整合有该质粒的细胞克隆。用荧光定量PCR、免疫荧光、Western blot、透射电镜等技术挑选稳定分泌HCV的单细胞克隆。 结果  成功筛选到稳定分泌HCV的单细胞克隆，该细胞克隆能够有效产生HCV相关蛋白，上清液中HCV滴度达到1×107拷贝/ml，电子显微镜观察HCV直径为55 nm，上清液中病毒滴度随干扰素α浓度的升高而降低。 结论  利用核酶自剪切机制可建立稳定分泌HCV的细胞模型，该模型可用于抗HCV药物的筛选。

【关键词】肝炎病毒，丙型； 基因； 转染

Construction of HCV-producing cell model based on self-cleaving ribozyme    WANG Sheng, AN Xiao-ping, MI Zhi-qiang, LIU Da-bin, ZHANG Bao-zhong, L Jun, ZHOU Yu-sen, TONG Yi-gang. State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China

Corresponding author: TONG Yi-gang, Email: tong.yigang@gmail.com

Co-corresponding author: ZHOU Yu-sen, Email: zhouys01@yahoo.com

Co-corresponding author: L Jun, Email: lujun@gmail.com

【Abstract】 Objective    To construct a stable HCV-producing cell model for anti-HCV drug research. Methods    The HCV-ribozyme recombinant plasmid pJFH1-Rbz was constructed to generate the exact 5′and 3′ends of HCV genomic RNA by placing two self-cleaving ribozymes at both ends of the HCV JFH-1 cDNA. The plasmid was then transfected into HepG2 cells and the resultant clones were screened with G418. Subsequently, immunofluorescence and Western blot were performed to detect the expression of HCV core protein, HCV RNA level was quantitated by TaqMan real-time PCR method and HCV particles was detected by electron microscopy. Results    HCV core protein was detected in the screened cell clone, and the level of  HCV RNA was up to 1×107 in the culture medium. Electron microscopy showed the viral particles in the culture suspension were approximately 55 nm in diameter. IFN-treating experiment demonstrated that the HCV RNA level decreased with the increasing concentration of IFNα. Conclusions    We constructed a stable HCV-producing cell model which can be used for anti-HCV drug research.

【Key words】Hepatitis C virus;  Genes;  Transfection

Wakita等[1]报道从1例暴发型丙型肝炎患者血液中克隆并构建了HCV 2a型全基因组cDNA序列JFH-1株，经体外转录得到HCV基因组RNA（gRNA），电穿孔法转染至Huh-7细胞后，得到具有感染性的HCV。但该模型每次均需要经过体外转录再转染，操作繁琐且结果不稳定，同时也无法得到稳定分泌HCV的细胞系。我们在JFH-1原有质粒的基础上引入核酶（Rbz）序列[2]，把两段核酶序列分别构建在HCV完整基因组cDNA的5′端和3′端，构建重组质粒pJFH1-Rbz。该重组质粒稳定整合于HepG2基因组后，能够转录出两端含有核酶序列的HCV RNA，通过核酶的自剪切特性，就可以得到完整的HCV gRNA，从而省去体外转录和转染的步骤，建立相对稳定的HCV体外培养细胞模型。

材料与方法

1．材料：含有HCV全基因序列的重组质粒pJFH1由日本东京都神经科学研究所微生物学系Wakita教授惠赠；HepG2细胞由本室保存；脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；荧光定量PCR检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司（国药准字S20040078）；抗HCV核心单克隆抗体购自北京热景公司；封闭用山羊血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG及封片剂均购自北京中山金桥公司；质粒构建过程中用到的酶均购自美国New England Biolabs公司；细胞裂解缓冲液购自北京普利莱基因技术有限公司。

2. 质粒的构建：在原始克隆pJFH1的HCV全长基因组cDNA两端各加入1个核酶序列，并通过合适的酶切位点把两端含有核酶的HCV全长cDNA连接到真核表达载体pEGFP-N1的CMV启动子下游，得到目的质粒pJFH1-Rbz。将上述重组质粒pJFH1-Rbz中HCV NS5B基因中GDD的碱基序列突变为GND，使表达产物失去RNA聚合酶活性，得到阴性对照质粒pJFH1-Rbz/GND[1]。

3.细胞转染及稳定细胞系的筛选：pJFH1-Rbz/GDD和pJFH1-Rbz/GND转染HepG2细胞，操作按照Lipofectamine 2000说明书进行。转染24h，加入G418溶液至终浓度为0.7mg/ml，对转染细胞进行加压筛选，2周后，各孔均有大量细胞死亡，整合入转染质粒的细胞存活下来并分裂增殖。采用有限稀释法把存活细胞倍比稀释铺于96孔板，挑取单细胞克隆进行扩大培养，其中pJFH1-Rbz/GDD稳定克隆命名为HepG2/GDD，pJFH1-Rbz/GND稳定克隆命名为HepG2/GND。

4. RNA的提取及荧光定量PCR检测:取稳定克隆HepG2/GDD和阴性对照HepG2/GND培养上清液各50μl，按照深圳匹基公司HCV荧光定量PCR检测试剂盒操作流程，提取上清液中的RNA，经去除RNA酶的DNA酶Ⅰ处理，以避免DNA的污染。经酚抽提法得到纯净的RNA，按照试剂盒配制25μl反应体系，应用罗氏Lightcycler 2.0全自动荧光定量PCR仪完成反应。

5. 间接免疫荧光检测：将HepG2/GDD和正常HepG2细胞均匀铺于载玻片，用37℃预温的磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次10min，用4%的多聚甲醛于室温固定30min，PBS清洗。用0.2%聚乙二醇辛基苯基醚浸泡5min增强细胞膜的通透性，PBS清洗。用山羊血清室温封闭固定好的细胞30min，PBS清洗后，加入1∶400稀释的抗HCV核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育1h，PBS清洗，加入1∶1000稀释的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h，清洗后加入含有4′，6-二脒基-2-苯基吲哚的封片剂，荧光倒置显微镜下观察。

6. Western bolt检测：收集足量细胞，裂解缓冲液裂解后离心取上清液，按照4∶1的体积比加入5倍上样缓冲液，沸水浴15min。每孔上样40μl，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，之后转入聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶37℃封闭2h，抗HCV核心蛋白单克隆抗体4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育1h，电化学发光显色，暗室内曝光于胶片上。检测细胞裂解上清液中HCV核心蛋白的表达，同时设阴性对照和阳性对照。

7.透射电镜分析：收集细胞培养上清液15ml，慢慢搅动并加入氯化钠至浓度为0.5mol/L，再加入聚乙二醇6000至终浓度为10%，4℃过夜。8000r/min离心30min，收集沉淀，溶于100μl PBS中。用细滴管吸取1滴制备好的样品悬液，滴于铜网上，进行负染。完成负染后，应用透射电镜FEI TECNAI-10（购自荷兰飞利浦公司）观察病毒颗粒。

8. 干扰素（IFN）α治疗：将已经培养好的稳定克隆HepG2/GDD，培养于6孔板中，每孔加入不同剂量的IFNα，使其终浓度为10、100、500U/ml，3d后收集上清液，用荧光定量PCR方法检测上清液中HCV滴度。

结    果

1．荧光定量PCR检测结果：从培养上清液体中提取RNA经荧光定量PCR检测发现，样品的Cp值为26，而阴性对照Cp值为33，相差约7个循环（128倍）。

2. 间接免疫荧光检测结果：荧光视野与阴性对照相比，有明显的绿色荧光存在。表达后的HCV核心蛋白主要存在于细胞浆中核周围，其分布位置与感染状态下一致，见图1。

3. Western blot检测结果：HepG2/GDD细胞样品在约2×104位置有目的条带，与阳性对照大小相近，阴性对照无条带产生，见图2。                   

4．电子显微镜观察到细胞上清液中HCV病毒颗粒：HepG2/GND样品悬液经负染后电镜观察未见病毒样颗粒，而HepG2/GDD样品悬液经负染后于电子显微镜下观察可以看到直径约为55nm的HCV，见图3。

 5. IFNα治疗效果：HCV滴度随IFNα浓度升高而降低，见图4。

讨    论

目前建立的HCV体外培养细胞模型，存在HCV滴度较低或感染性差的问题。一些假病毒模型虽然可用来进行病毒侵入宿主细胞的相关研究，但却不能用来研究病毒的生命周期。Wakita等[1]建立的细胞模型能够产生较高浓度HCV颗粒，经感染实验验证该颗粒具有感染性。受此模型的启发，人们建立了多种能够表达HCV颗粒的体外培养细胞模型[3-5]。但这些模型都不能得到稳定分泌HCV颗粒的细胞系。本研究在此基础上，构建了一种能够稳定分泌HCV颗粒的细胞模型，该模型只需构建一种质粒，把该质粒转染HepG2细胞后，通过G418加压筛选，得到的克隆可以稳定地分泌具有感染性的HCV颗粒，简化了采用传统方法建立HCV体外培养细胞模型的复杂性，并给以后的进一步改造留下了可操作空间。

本研究中引入的核酶是该模型的关键。核酶是能够在特定部位进行自我剪切的一段RNA序列，通过把核酶序列构建在HCV cDNA的两侧，我们便可以达到在转染细胞内得到完整HCV gRNA的目的。HCV gRNA在细胞内翻译出结构蛋白和非结构蛋白，并在RNA依赖的RNA聚合酶扩增出更多的HCV gRNA，通过组装，便形成了HCV颗粒，分泌到细胞上清液中。由于质粒转染入细胞后，HCV的翻译、组装都是在细胞内完成，这样便减少了外界环境和人为因素的影响。

该模型可以为研究HCV的生命周期提供一个很好的平台，但不适合用来研究HCV侵入细胞的机制。HCV在体外培养时，能够导致细胞的病变，在该模型中有所体现，但是从近3个月的连续传代培养来看，病变并不明显，也未致细胞死亡。

参  考  文  献

[1]Wakita T, Pietschmann T, Kato T, et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med, 2005, 11: 791-796.

[2]Heller T, Saito S, Auerbach J, et al. An in vitro model of hepatitis C  virion production. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102: 2579-2583.

[3]Nam JH, Bukh J, Purcell RH, et al. High-level expression of hepatitis C virus (HCV) structural proteins by a chimeric HCV/BVDV genome propagated as a BVDV pseudotype. J Virol Methods, 2001,97: 113-123.

[4]Bartosch B, Bukh J, Meunier JC, et al. In vitro assay for neutralizing antibody to hepatitis C virus: evidence for broadly conserved neutralization epitopes. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:  14199-14204.

[5]Logvinoff C, Major ME, Oldach D, et al. Neutralizing antibody response during acute and chronic hepatitis C virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101: 10149-10154.

(收稿日期：2009-11-27)

(本文编辑：孙宇航)

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