商陆抗病毒蛋白不同结构域的抗乙型肝炎病毒活性

【摘要】  目的  比较全长和不同片段缺失型商陆抗病毒蛋白（PAP）基因真核表达质粒体外抗HBV作用及其细胞毒性作用。 方法  将全长和不同片段缺失型PAP基因真核表达质粒用脂质体转染HepG2.2.15细胞，收获生长良好的HepG2.2.15细胞，转染前1d，接种于24孔培养细胞板，培养20h后，待细胞密度达到40%～50%时进行转染。细胞随机分为4组：pXF3H组,转染空质粒pXF3H作为对照；pXF3H-PAP12组，转染全长PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP12；pXF3H-PAP14组，转染C端缺失25个氨基酸的PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP14；pXF3H-PAP34组，转染既缺失N端69个氨基酸又缺失C端25个氨基酸的PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP34。转染的质粒剂量为每孔1.0μg，终浓度为2.0μg/ml，质粒DNA (μg）和脂质体（μl）的比例为1∶2.5，转染72h后收集细胞及培养上清液。酶联免疫吸附法检测培养上清液HBsAg和HBeAg，荧光定量PCR检测HBV DNA水平，四甲基偶氮唑盐比色法检测各质粒对转染细胞的毒性作用。应用SPSS12.0软件包处理数据,两样本均数的比较采用t检验,率的比较采用χ2检验。 结果  对HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制率，pXF3H-PAP14组分别为56.3%、75.8%和61.7%，pXF3H-PAP12组分别为61.4%、84.2%和63.2%，两组间差异无统计学意义。但pXF3H-PAP14组细胞毒性（抑制率为10.2%）明显低于pXF3H-PAP12组（抑制率为27.1%），χ2＝7.7，P<0.01。pXF3H-PAP34组无细胞毒性，但其抗HBV作用也丧失，对HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制率分别为7.8%、11.0%、20.5%。 结论  PAP的C端25个氨基酸与细胞毒性相关，与抗HBV活性无关；PAP的N端69个氨基酸与抗HBV活性相关。

【关键词】  肝炎病毒，乙型； 抗病毒药； 商陆抗病毒蛋白

The effects of different PAP domains on hepatitis B virus replication   GUO Chun-xia, HE Yong-wen, PENG Cheng, LEI Yan-chang, LI Wen-ting. Department of Infectious Disease, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

Corresponding author: HE Yong-wen, Email: hyw581441@yahoo.com.cn

【Abstract】    Objective    To investigate the effects of different PAP domains on hepatitis B virus replication. Methods    The full length and two truncated PAP mutants were cloned into a eukaryotic expression plasmid, and were transfected into HepG2.2.15 cells using lipofectamine 2000. 3 days after transfection, the medium and cells were collected. HBsAg and HBeAg were measured using ELISA. The titers of HBV DNA were quantified using fluorogenic quantitative PCR (FQ-PCR). HepG2 cells were used to determine the cytotoxicity of the plasmids transfection by MTT assays. Results    The inhibitory effect on HBV replication of the C-terminal 25 amino acids deleted PAP mutant (pXF3H-PAP14) was not significantly different from that of the full length PAP (pXF3H-PAP12) (χ2 = 0.5, 2.0, 0.02, P > 0.05), however, the cytotoxicity of pXF3H-PAP14 was lower than that of pXF3H-PAP12 (χ2 = 7.7, P < 0.01). Both N-terminal 69 amino acids deleted mutant and C-terminal 25 amino acids deleted mutant had no cytotoxicity and no antiviral activity. Conclusion    C-terminal 25 amino acid of PAP is related to cytotoxicity but not related to antiviral activity of PAP. N-terminal 69 amino acid of PAP is related to the anti-HBV effect of PAP.

【Key words】     Hepatitis B virus;    Antiviral agents;    Pokeweed antiviral protein

商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein，PAP）是一种天然的广谱抗病毒蛋白, 成熟的PAP由262个氨基酸组成[1]，包括氨基端结构域（1～69氨基端残基）、中心结构域（70～179氨基端残基）和羧基端结构域（180～262氨基端残基）。研究显示，PAP具有显著抑制HBV复制的作用，同时也有一定的细胞毒性[2-3]。本实验构建全长及不同片段缺失型PAP基因的真核表达载体，以HepG2.2.15细胞为模型，比较其体外抗HBV的作用及细胞毒性作用，以初步了解PAP抗HBV的活性区域及细胞毒作用区域。

材料与方法

1. 质粒构建：根据目前公布的PAP的序列（gi：218010），以含全长PAP基因的质粒PGEM-PAP为模板（云南省农业生物技术重点实验室鄢波教授惠赠）,引物由上海英骏公司设计合成，上游引物P1：5′-CGGGATCCAATAAATACAATCACC TTCGATG-3′，下游引物P2：5′-CCCAAGCTTGT AAGTTGCCTGGCAGGTCCCA-3′，上游引物P3：5′-CGGGATCCAAACTTGTATGTGATGGG CTATG-3′，下游引物P4：5′-CCCAAGCTTTAT CCACTTGCTACCGTTTGCA-3′，PCR分别扩增全长的PAP基因（以P1、P2为引物）、C端缺失25个氨基酸的PAP基因（以P1、P4为引物）、既缺失N端69个氨基酸又缺失C端25个氨基酸的PAP基因（以P3、P4为引物）。TA克隆到pMD18-T载体（购自日本TaKaRa公司）中，经PCR、酶切、由上海英骏公司测序确证后，将它们用BamHⅠ和HindⅢ（购自日本TaKaRa公司）双酶切后，以正确读码框插入到经同样酶切、带有人血凝素标签的真核表达载体pXF3H（同济医院临床免疫室惠赠）中，分别命名为pXF3H-PAP12、pXF3H-PAP14、pXF3H-PAP34。

2. HepG2.2.15细胞的转染：将上述3种质粒小量抽提（购自日本TaKaRa公司），进行酶切、测序鉴定。将鉴定成功的质粒用无内毒素质粒抽提试剂盒（购自北京天根生化科技公司）大量抽提纯化，为转染做准备。用lipofectamine 2000转染试剂盒（购自美国Invitrogen公司）进行细胞转染，按说明书操作。收获生长良好的HepG2.2.15细胞，转染前1d，胰酶消化细胞并计数，接种于24孔培养细胞板（1×105个/孔），37℃ 5% CO2培养箱（购自美国Forma Scientific公司）中培养20h后，待细胞密度达到40%～50%时进行转染。细胞随机分为4组：pXF3H组，转染空质粒pXF3H作为对照；pXF3H-PAP12组，转染全长PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP12；pXF3H-PAP14组，转染C端缺失25个氨基酸的PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP14；pXF3H-PAP34组，转染既缺失N端69个氨基酸又缺失C端25个氨基酸的PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP34。转染的质粒剂量为每孔1.0μg，终浓度为2.0μg/ml，质粒DNA（μg）和脂质体（μl）的比例为1∶2.5，每组设3个复孔，实验重复2次，取平均值进行分析。转染72h后收集细胞及培养上清液。

3. RT-PCR及Western blot检测转染HepG 2.2.15细胞中PAP的表达：提取细胞RNA后，RT-PCR扩增，产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪（购自温州医疗仪器厂）下观察结果。提取细胞总蛋白，进行十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳后半干转移至硝酸纤维素膜上，封闭过夜，加第一抗体和第二抗体，强化化学发光法显色，X片曝光，显影定影后观察结果。

4. 酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养上清液中HBsAg、HBeAg的水平：应用HBsAg、HBeAg检测试剂盒（ELISA，购自上海科华生物公司）检测培养上清液中HBsAg、HBeAg的水平，结果以S/N值表示，S/N＝标本A值/阴性对照A值，按以下公式计算抗原的抑制率：（对照孔S/N值－实验孔S/N值）/（对照孔S/N值－2.1）×100%。

5. 荧光定量PCR检测细胞上清液中HBV DNA的水平：应用深圳匹基公司的定量PCR试剂盒（荧光探针法）检测，结果用“拷贝/ml”表示，检测限度为500拷贝/ml。

6. 细胞毒性检测：应用四甲基偶氮唑盐比色法测定pXF3H-PAP12、pXF3H-PAP14、pXF3H-PAP34 质粒对HepG2细胞的毒性作用，同时以转染空质粒pXF3H、转染脂质体为两组对照。

7. 统计学分析：数据以均数±标准差（x-±s）表示，两样本均数的比较采用t检验,率的比较采用χ2检验，应用SPSS12.0软件包处理数据。

结    果

1. 质粒构建：成功构建了不同缺失型PAP基因片段的克隆载体及表达载体，酶切结果见(图略)。

2. 转染细胞的RT-PCR鉴定：提取细胞RNA后，RT-PCR扩增，可见有mRNA表达，表明各质粒转染入HepG2.2.15细胞后，有瞬时表达，见图3。

3. Western blot检测PAP在转染细胞中的表达：各个细胞培养孔之间带血凝素标签的商陆抗病毒蛋白融合蛋白的表达水平接近，提示细胞之间转染效率大致相同,见图4。

4. 全长和不同缺失型PAP质粒对HBsAg、HBeAg表达的抑制作用比较：转染后72h，pXF3H对照组、pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14组、pXF3H-PAP34组，HBsAg水平S/N分别为3.55±0.18、2.66±0.07、2.73±0.05和3.44±0.11；pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14组、pXF3H-PAP34组对HBsAg的抑制率分别为61.4%、56.3%、7.8%，pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14组与pXF3H对照组比较，χ2值分别为77.3和67.5，P值均<0.01，差异有统计学意义，pXF3H-PAP34组与pXF3H对照组比较，χ2＝2.4，P>0.05，差异无统计学意义。pXF3H对照组、pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14组、pXF3H-PAP34组，HBeAg水平S/N分别为7.57±0.35、2.97±0.14、3.42±0.02和6.97±0.10；pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14组、pXF3H-PAP34组对HBeAg的抑制率分别为84.2%、75.8%、11.0%，pXF3H-PAP12、组pXF3H-PAP14组与pXF3H对照组比较，χ2值分别为112.6和101.6，P值均<0.01，差异有统计学意义，pXF3H-PAP34组与pXF3H对照组比较，χ2＝2.7，P>0.05，差异无统计学意义。pXF3H-PAP14组对HBsAg、HBeAg的抑制率与pXF3H-PAP12组比较，差异无统计学意义。pXF3H-PAP34组对HBsAg、HBeAg的抑制率明显低于pXF3H-PAP12组，χ2值分别为62.2和106.8，P值均<0.01，差异有统计学意义。

5. 全长和不同缺失型PAP质粒对HBV DNA的抑制作用比较：转染后72h，pXF3H对照组、pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14、组pXF3H-PAP34组HBV DNA分别为（8.23±0.36）×105拷贝/ml、（3.03±0.51）×105拷贝/ml、（3.15±0.34）×105/拷贝ml、（6.54±0.42）×105拷贝/ml。pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14、组pXF3H-PAP34组对HBV DNA的抑制率分别为63.2%、61.7%、20.5%，与pXF3H对照组比较，χ2值分别为71.9、70.0和9.5，P值均<0.01，差异有统计学意义。pXF3H-PAP14组对HBV DNA的抑制率与pXF3H-PAP12组比较，差异无统计学意义，pXF3H-PAP34组对HBV DNA的抑制率明显低于pXF3H-PAP12组，χ2＝36.8，P<0.01，差异有统计学意义。

6. 全长和不同缺失型PAP质粒的细胞毒作用比较：脂质体组、pXF3H对照组、pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14组、pXF3H-PAP34组，四甲基偶氮唑盐比色法测定A值分别为0.543±0.08、0.547±0.09、0.399±0.04、0.491±0.04、0.533±0.07，pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14组、pXF3H-PAP34组对细胞的抑制率分别为27.1%、10.2%和2.6%，pXF3H-PAP34组与pXF3H对照组比较，差异无统计学意义；pXF3H-PAP12组、pXF3H-PAP14组与pXF3H对照组比较，χ2值分别为30.6和9.8，P值均<0.01，差异有统计学意义。表明pXF3H-PAP34对细胞无明显毒性作用，pXF3H-PAP14对细胞的毒性作用明显低于pXF3H-PAP12，χ2＝7.7，P<0.01，差异有统计学意义。

讨    论

天然PAP及全长PAP基因的真核表达质粒在HepG2.2.15细胞模型中都具有抗HBV作用，但天然PAP浓度超过50μg/ml时或全长PAP基因的真核表达质粒转染剂量较大时有一定的细胞毒性[2-3]。

实验结果显示：转染后72h，2.0μg/ml pXF3H-PAP14质粒对HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制率与pXF3H-PAP12质粒相比,差异无统计学意义，而pXF3H-PAP34质粒对HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制率明显低于pXF3H-PAP12质粒。表明缺失C端25个氨基酸的PAP真核表达质粒与全长PAP真核表达质粒相比，其抗HBV活性无明显差异；而既缺失N端69个氨基酸又缺失C端25个氨基酸的PAP真核表达质粒对HBV抑制作用很小。表明去掉C端25个氨基酸不影响PAP的抗HBV活性，但去掉N端69个氨基酸就影响PAP的抗HBV活性。

实验结果显示：脂质体、空载体pXF3H、pXF3H-PAP34对细胞无明显毒性作用，pXF3H-PAP14对细胞的毒性作用明显低于pXF3H-PAP12。提示既缺失N端69个氨基酸又缺失C端25个氨基酸的PAP真核表达质粒对细胞无明显毒性作用；缺失C端25个氨基酸的PAP真核表达质粒的毒性作用明显低于全长PAP，对细胞有较小的毒性作用。

综合以上抗HBV活性及细胞毒作用结果显示：去掉C端25个氨基酸的PAP的抗HBV作用与全长PAP无明显差异，其细胞毒性明显低于全长PAP；提示C端25个氨基酸与抗HBV活性无关，与细胞毒性有关。但与正常对照组相比，去掉C端25个氨基酸的PAP仍有较小的细胞毒性，推测可能在PAP的其他区域的氨基酸也与细胞毒性相关。既去掉N端69个氨基酸又去掉C端25个氨基酸的PAP无细胞毒性作用，但其抗HBV作用也丧失。

PAP在抗人类免疫缺陷病毒、植物病毒方面的研究结果显示，PAP具有不同的功能区[4-5]。本研究结果显示PAP的C端25个氨基酸与抗HBV活性无关，与细胞毒性作用有关；而N端69个氨基酸却影响着PAP的抗HBV活性。虽然PAP的中心结构域对于抗HBV作用很重要，但是如果只保留中心结构域，而将N端69个氨基酸去掉，则丧失了抗HBV活性。这可能是因为PAP的N端69个氨基酸影响着PAP的结构稳定性或蛋白活性；也可能是因为在这69个氨基酸中也存在抗病毒活性区。Hudak等[6]报道在PAP N端的第70～76位处的氨基酸是RNA结合域，可以识别病毒的RNA并将其作为底物脱嘌呤，因此，还有可能是去掉了N端69个氨基酸后，70～76位处的氨基酸不能形成RNA结合域从而破坏了其抗HBV活性。

本实验结果显示，PAP的C端25个氨基酸与细胞毒性相关，与抗HBV活性无关；PAP的N端69个氨基酸与抗HBV活性相关，从而初步明确了PAP抗HBV的活性区域及细胞毒作用区域，为将来更加有效的改造PAP基因使其抗HBV活性增加而对宿主的毒性降到最低来达到治疗HBV的目的，为探索新的抗HBV的药物提供了理论依据。

参  考  文  献

[1]Tumer NE, Hwang DJ, Bonness M. C-terminal deletion mutant of pokeweed antiviral protein inhibits viral infection but does not depurinate host ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94: 3866-3871.

[2]He YW, Pan YF, Wang P, et al. The effects of pokeweed antiviral protein from seeds on the replication of hepatitis B virus in vitro. Shiyong Ganzangbing Zazhi, 2004, 7: 80-82. (in Chinese)

贺永文,潘延凤,王萍，等.商陆抗病毒蛋白体外对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响.实用肝脏病杂志,2004,7:80-82.

[3]He YW, Guo CX, Lei YC. The inhibitory effects on hepatitis B virus of pokeweed antiviral protein in vitro. Zhonghua Neike Zazhi,2007, 46: 859-861. (in Chinese)

贺永文，郭春霞，雷延昌.商陆抗病毒蛋白体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究.中华内科杂志,2007,46:859-861.

[4]Kurinov IV, Uckun FM. High resolution X-ray structure of potent anti-HIV pokeweed antiviral protein-III. Biochem Pharmacol, 2003,65: 1709-1717.

[5]Nagasawa Y, Fujii K, Yoshikawa T, et al. Pokeweed antiviral protein region Gly209-Lys225 is critical for RNA N-glycosidase activity of the prokaryotic ribosome. Phytochemistry, 2008, 69: 1653-1660.

[6]Hudak KA, Wang P, Tumer NE. A novel mechanism for inhibition of translation by pokeweed antiviral protein: depurination of the capped RNA template. Rna, 2000, 6: 369-380.

（收稿日期：2009-04-26）

（本文编辑：袁平戈）

中华肝脏病杂志版权