蒿鳖养阴软坚方对小鼠血吸虫病肝纤维化的疗效

【摘要】  目的  探讨蒿鳖养阴软坚方对小鼠血吸虫病肝纤维化的治疗作用。 方法  随机取8只小鼠为正常对照组，其余小鼠每只用日本血吸虫尾蚴（26±1）条经腹壁皮肤感染；12周后再将感染小鼠按体质量随机区组法分为短期感染对照（短模）组和长期感染对照 (长模) 组、蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量（11.58、3.66、1.16g/kg）组、阳性药物（包括复方鳖甲软肝片和秋水仙碱）对照组。处死短模组小鼠，证实肝纤维化形成后给予治疗用药。蒿鳖养阴软坚方组给予蒿鳖养阴软坚方干粉状提取物混悬液灌胃，每日1次，共12周。光学显微镜观察肝组织病理学变化；盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸含量；放射免疫法测定血清透明质酸和Ⅲ型前胶原水平；明胶酶谱法测定肝组织基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9水平。对正态分布计量资料多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时用Tukey HSD检验，方差不齐时用Tamhane检验；对纤维化程度计分行非参数统计Mann-Whitney U检验；对纤维化程度分期行Ridit分析。 结果  短模组和长模组小鼠肝组织均出现大量炎性细胞浸润及钙化的虫卵结节，大量胶原纤维分布于虫卵肉芽肿周围和汇管区，甚至形成假小叶；蒿鳖养阴软坚方可明显减轻血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏的病理学改变，其各剂量均能显著降低肝纤维化分期（u值分别为3.964、5.184、3.438，P值均<0.01）及计分 (P值均<0.01)，其中高剂量组的纤维化程度分期低于阳性对照药（u值分别为32.204、2.451，P值均<0.05)，且其计分低于秋水仙碱组（P<0.05）。短模组［(6.07±2.46) mg/g］和长模组［(7.84±4.12) mg/g］胶原蛋白含量显著高于正常对照组［(0.24± 0.27) mg/g］，P值均<0.01；蒿鳖养阴软坚方高剂量组［(1.88±1.62) mg/g]、中剂量组［(2.18±2.16) mg/g］明显低于长模组（P<0.05）。短模组［(1110.72±139.34) ng/ml］和长模组［(1062.62±65.81) ng/ml］透明质酸水平显著高于正常对照组［(647.52±360.29) ng/ml］，P值均<0.05；蒿鳖养阴软坚方中剂量组［(677.04±256.93) ng/ml］、低剂量组［(733.96±273.14) ng/ml］明显低于长模组（P值均<0.05）。短模组和长模组MMP-9水解条带的亮度分别为（2.93±0.79）×105、（3.30±0.43）×105，显著高于正常对照组［(1.18±0.30)×105］，P<0.01；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组［(2.29±0.70) ×105、（2.33±0.56）×105、（2.40±0.74)×105］明显低于长模组（P值均<0.05）；短模组和长模组MMP-9水解条带的面积（116.75±27.46，118.79±26.77）显著高于正常对照组（45.83± 7.17），P值均<0.01。短模组和长模组MMP-2水解条带的亮度［(2.48±0.61) ×105、（2.79±0.61)×105］显著高于正常对照组［(1.17±0.31) ×105，P值均<0.01］；短模组和长模组MMP-2水解条带的面积（93.56±20.13、101.74±21.77）显著高于正常对照组（44.86±12.10，P值均<0.01），蒿鳖养阴软坚方高剂量组（69.40±27.64）明显低于长模组（P<0.05）。 结论  蒿鳖养阴软坚方对小鼠血吸虫病肝纤维化有确切的治疗作用，其机制之一可能是降低肝组织MMP-2及MMP-9水平。

【关键词】  肝硬化； 血吸虫病； 羟脯氨酸； 透明质酸； 基质金属蛋白酶-2； 基质金属蛋白酶-9； 蒿鳖养阴软坚方

Therapeutic effect of Haobieyangyinruanjianfang on the mouse liver fibrosis caused by schistosomiasis   ZHANG Zhu, LIU Jie-ying, FANG Bu-wu. Department of Chemistry,  Tianjin Medical University, Tianjin  300070, China

Corresponding author: FANG Bu-wu, Email: fangdch@yahoo.com.cn

【Abstract】    Objective    To explore therapeutic effect of Haobieyangyinruanjianfang (HBYYRJ) on mouse liver fibrosis by schistosomiasis. Methods    Mice except for normal control were infected with Japanese schistosome cercarias, after 12 weeks, infected mice were divided into 7 groups: low HBYYRJ group, middle HBYYRJ group, high HBYYRJ group, Fufangbiejiaruangan tablet (FFBJRG) group, colchicine group, 3 months infection group and 6 months infection group. Hepatic fibrosis was found in 3 months infection group. Liver hydroxyproline (Hyp) was determined, matrix metalloproteinase-2 and 9 (MMP-2, MMP-9) were detected with gelatin zymography, serum hyaluronic acid (HA) and precollagen III (PC-III) were detected using RIA. Results    HBYYRJ obviously reduced hepatic fibrosis (P < 0.01). Collagen and HA in 3 months infection group and 6 months infection group were higher than that in normal group (P < 0.01), collagen in high and middle HBYYRJ groups and HA in middle and low HBYYRJ groups were lower than that in 6 months infection group (P < 0.01, P < 0.05). The expression of MMP-9 and MMP-2 in 3 months infection group and 6 months infection group was higher than that in normal group(P<0.01), The expression of MMP-9 in three HBYYRJ groups and the expression of MMP-2 in high HBYYRJ group were lower than that in 6 months infection group (P < 0.05). Conclusion    HBYYRJ can reduce liver fibrosis caused by schistosomiasis.

【Key words】     Liver cirrhosis;    Schistosomiasis;    Hydroxyproline;    Hyaluronic acid;    Matrix metalloproteinase-2;    Matrix metalloproteinase-9;    Haobieyangyinruanjianfang

近年来长江流域血吸虫病散在流行，而血吸虫感染引起的肝纤维化和肝硬化则是血吸虫病患者的主要死因。彻底的病因治疗并不能中止血吸虫病肝纤维化的进展，而多数动物实验结果表明杀虫治疗后采用抗肝纤维化治疗才能基本控制肝纤维化[1-2]；但仍未见理想的抗肝纤维化药物。本研究制备小鼠血吸虫病肝纤维化模型，成模后以蒿鳖养阴软坚方为治疗药物，以明确该药的治疗作用并初步探讨其作用机制，为血吸虫病肝纤维化的治疗提供实验依据。

材料与方法

1. 血吸虫虫株：35只鄱阳湖湖区阳性钉螺湖北亚种购自江西省寄生虫病防治研究所，于潮湿温暖环境饲养1周，待用。

2．实验动物：清洁级昆明种小鼠150只，雌雄各半，体质量17～19g；购自中国军事医学科学院实验动物中心。以小鼠标准饲料饲养，自由进食及饮水。

3．药物：蒿鳖养阴软坚方源于临床用药经验并化裁于青蒿鳖甲汤，其组分为：青蒿、鳖甲、生地、知母、丹参、虎杖、白花蛇舌草等，按照正交实验和药理筛选结果确立的提取工艺，并以中试规模制备为粉状原料药，给药前配成混悬液。吡喹酮片（批号: 0704001），购自汉中爱诺药品有限公司。复方鳖甲软肝片（批号：20080206），购自内蒙古福瑞中蒙药科技有限公司。吡喹酮片和复方鳖甲软肝片在给药前均研磨成粉末，并制成混悬液。秋水仙碱购自美国Sigma公司。

4．主要试剂与仪器：羟脯氨酸标准品，购自南京建成生物工程研究所，批号：20080310；透明质酸、Ⅲ型前胶原放射免疫试剂盒，购自北方生物技术研究所，批号20080720；蛋白质定量试剂盒，购自天根生物技术公司；凝胶配制试剂盒，购自江苏碧云天生物技术研究所；低分子量蛋白质标准，购自北京全式金生物技术公司，批号 20081106；曲拉通X-100、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝购自美国Sigma公司。恒温水浴振荡器，购自哈尔滨东联电子仪器厂；低温高速离心机，购自德国Eppendorf公司；小型电泳仪、垂直电泳槽和凝胶分析仪，购自美国Bio-Rad公司。

5. 动物分组与处理：按体质量随机区组法分组：分别对雌性与雄性小鼠按体质量由重至轻或由轻至重排列，分7组，则每7只体质量相邻的鼠为1区，从随机数字表的任何一行与任何一列开始，连续取6个随机数字，依次除以7、6、5、4、3、2，视余数为几即分至第几组，整除者可将除数作为余数，其余各区例同。每组雌、雄鼠数相等或接近。取8只为正常对照组，其余142只小鼠经腹壁皮肤感染血吸虫尾蚴（26±1）条/只，感染时间20min[3]；此后常规饲养3个月，为造模期。感染后第1、2个月各随机处死2只小鼠，观察肝脏大体形态及镜下变化情况。感染后1个月，肝脏出现炎症反应；感染后2个月，虫卵肉芽肿形成，此时对全部感染小鼠以吡喹酮（200mg·kg-1·d-1，连续3d）杀虫治疗；感染后3个月，处死与感染致死共32只，另处死10只小鼠为短期感染模型对照（短模）组，检测肝组织病理学变化和羟脯氨酸含量以证实肝纤维化形成；并开始治疗用药3个月。

成模后对感染小鼠按体质量随机区组法分为6组：长期感染模型对照 (长模) 组14只，蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组分别有14、16、16只，阳性中药对照组15只，阳性西药对照组15只；依次灌喂蒸馏水、蒿鳖养阴软坚方11.58、3.66g/kg（相当于人的临床用药剂量）、1.16g/kg与复方鳖甲软肝片0.77g/kg、秋水仙碱0.128mg/kg，剂量分别由各药的临床用药剂量按体表面积计算公式获得：dB＝dA·RB/RA·(WA/WB)1/3，式中dB、dA分别为小鼠和人的用药剂量（g/kg），RB、RA分别为小鼠和人的体型系数0.059和0.1，WB、WA分别为小鼠和人的标准体质量20g和70kg；正常组灌喂蒸馏水，均1次/d，每周6d，连续12周。治疗结束后以20%乌拉坦麻醉，腹腔静脉取血，3500r/min离心20min，吸取血清，分装，-20℃保存；取肝组织并分为3部分，均以10%甲醛溶液固定、脱水，-80℃保存。

6．病理学检查：肝组织常规石蜡切片，HE染色，并行显示胶原纤维、细胞和肌肉的新染法，其中胶原纤维呈鲜红色，细胞核和血细胞呈绿色，肌肉呈黄色[4]。光学显微镜下观察肝组织病理学变化，据胶原纤维增生情况进行纤维化程度评分[5]。

7．肝组织羟脯氨酸测定：肝组织以三氯甲烷/甲醇（2∶1，V/V）充分脱水，研磨，称质量；取40mg干粉，加入6mol/L盐酸6ml，105℃水解18h。水解液过滤后取50μl烘干，按Jamall法测定：加50%异丙醇1.2ml，加0.56%氯胺T溶液0.2ml，室温放置10min；加入1ml ER工作液（10g对二甲氨基苯甲醛溶于11ml 60%过氯酸，测定前取该液9ml，与24ml异丙醇混匀即得），混匀，50℃水浴90min；在波长558nm处测吸光度值。蒸馏水调零，空白试剂校正，通过标准曲线求羟脯氨酸含量(μg/mg)，乘以系数22.38 (μg/mg＝mg/g，胶原蛋白/肝干粉)即为胶原蛋白含量。

8. 血清透明质酸和Ⅲ型前胶原水平测定：按放射免疫试剂盒说明书进行操作。

9．肝组织基质金属蛋白酶（matrix metal-loproteinase，MMP）-2及MMP-9活性测定：采用明胶酶谱法[6-7]。取-80℃冻存的小鼠肝组织50mg，用磷酸盐缓冲液冰浴匀浆，12000r/min离心30min抽提蛋白质。用考马斯亮蓝G-250法进行蛋白质定量。配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶（底物明胶已加入），以每孔50μg蛋白质上样，进行电泳。电泳结束后，凝胶经洗脱、孵育、考马斯亮蓝染色、脱色至显示出MMP-2和MMP-9为位于蓝色背景上的透亮带。经标准蛋白质对照，均为酶原型MMP。以凝胶成像仪扫描，用Bio-Rad Quantity One分析软件测定酶分解条带的亮度和面积。

10．统计学分析：采用SPSS10.0统计软件，对正态分布计量资料多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时用Tukey HSD检验，方差不齐时用Tamhane检验；对纤维化程度计分行非参数统计Mann-Whitney U检验；对纤维化程度分期行Ridit分析。

结    果

1．小鼠存活情况：进入治疗期的小鼠共108只，治疗期间死亡14只，其中长模组4只，蒿鳖养阴软坚方高剂量组3只、中剂量组1只、低剂量组2只，阳性中药组1只，阳性西药组3只。

2．肝组织病理学变化：正常对照组小鼠肝小叶结构正常，无纤维组织增生。感染对照组（包括短模组和长模组）小鼠肝组织则表现为典型血吸虫病肝纤维化：炎症细胞浸润及大量已钙化虫卵结节，大量胶原纤维分布于虫卵肉芽肿周围和汇管区；病变严重者可见肝组织被胶原纤维完全分隔，形成假小叶。治疗组小鼠肝组织在病变范围和程度上与感染组比较，均有不同程度减轻。见图1～8。

肝纤维化程度分期及计分，此二者在短、长模组均分别显著高于正常组，各治疗组皆明显低于长模组；并且蒿鳖养阴软坚方高剂量组的纤维化程度分期低于复方鳖甲软肝片及秋水仙碱组，差异具有统计学意义（P<0.01），同时其纤维化程度计分亦低于秋水仙碱组（P<0.05），见表（略）。

3． 肝组织胶原蛋白含量变化：与正常组比较，感染对照组（包括短模组和长模组）小鼠肝组织胶原蛋白含量显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01）；蒿鳖养阴软坚方高、中剂量组胶原蛋白含量均明显低于长模组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表（略）。

4．血清透明质酸和Ⅲ型前胶原的变化：与正常组比较，感染对照组（包括短模组和长模组）小鼠血清透明质酸水平显著升高（P<0.01或P<0.05）；蒿鳖养阴软坚方组（包括中、低剂量组）较长模组明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）。感染对照组（包括短模组和长模组）小鼠血清Ⅲ型前胶原水平升高，但各组间差异未见统计学意义。见表（略）。

5． 肝组织MMP-2及MMP-9的水平：与正常组比较，短模组和长模组小鼠肝组织MMP-9和MMP-2的面积和亮度均显著升高（P<0.01）；与长模组比较，蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组的MMP-9亮度均明显降低（P<0.05），蒿鳖养阴软坚方高剂量组的MMP-2面积明显降低（P<0.05），其亮度呈降低趋势，见图（略）。表（略）。

讨    论

本研究用昆明种小鼠感染血吸虫尾蚴后随机动态处死小鼠以观察肝脏病变，感染后第1个月，小鼠肝脏未见明显病变。感染第2个月，小鼠肝脏轻度肿大，暗紫色，夹白色粟粒样结节；光学显微镜下见典型虫卵肉芽肿。感染第3个月之后，小鼠肝脏显著肿大，质地较硬，表面密布白色粟粒样结节；光学显微镜下见大量胶原纤维分布于虫卵结节周围和汇管区，呈“干线性”肝纤维化特征，为典型血吸虫病肝纤维化病理学改变；同时肝组织胶原蛋白含量和血清透明质酸水平均显著升高，血清Ⅲ型前胶原水平也增高，表明血吸虫病肝纤维化模型形成。同时分别对胶原蛋白、透明质酸、Ⅲ型前胶原、MMP-2和MMP-9在各组内雌、雄鼠之间进行比较，结果未显示性别对这些指标的变化有影响。

由于阴虚血瘀、血热毒蕴是临床上慢性肝病，特别是活动期慢性肝病的重要证型之一，而目前上市的抗肝纤维化复方几乎均以益气活血为主，故本研究中蒿鳖养阴软坚方立法于养阴软坚散结、凉血活血解毒。蒿鳖养阴软坚方在小鼠成模后用药能显著降低肝纤维化程度分期和计分，其高、中剂量能显著降低肝胶原蛋白含量，其中、低剂量能明显降低血清透明质酸水平。表明蒿鳖养阴软坚方对血吸虫病肝纤维化具有治疗作用，总体疗效在一定程度上优于复方鳖甲软肝片和秋水仙碱。由于各药的纯度不同，宜以临床等效剂量进行比较，不能强求用量相同，否则有些药物将过量并引起中毒。

MMP-2、MMP-9能降解变性胶原（明胶）、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原及非胶原蛋白（如弹力蛋白、纤维结合蛋白、层黏连蛋白等）。由Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和蛋白多糖等组成的基底膜样物质存在于正常肝窦内皮下，沉积过多可激活肝星状细胞变为肌成纤维细胞样细胞，分泌大量胶原、沉积于Disse间隙，导致肝纤维化[8]。兔感染后10周，肝胶原和MMP-9 mRNA表达水平达峰值[9]。毗邻肝纤维化虫卵肉芽肿的肝星状细胞持续活化，单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、MMP-9等与整个肝脏病变进展相平行[10]。晚期血吸虫病患者肝组织MMP-2及MMP-9仍明显增多，特别是MMP-2随汇管区炎症和纤维化程度加重而增加[11]。感染后6周小鼠肝窦内皮细胞窗孔减少；8周肝窦周隙内充满大量胶原纤维束，肝窦内皮细胞窗孔明显减少，细胞外侧有基底膜形成, 即为肝窦毛细血管化[3]。本研究结果表明，感染后6个月血吸虫病肝纤维化小鼠肝组织酶原型MMP-2、MMP-9显著增多，感染3个月后开始分别用蒿鳖养阴软坚方11.58、3.66、1.16g/kg治疗3个月，均能显著降低MMP-9水平，11.58g/kg也明显降低MM-2水平，从而保护了肝血窦基底膜，防止肝窦毛细血管化及胶原化，这可能是其抗肝纤维化的机制之一。并可能通过其他机制降解Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质；由于降低的为其酶原型，故该方剂可能主要是抑制MMP-9及MMP-2的产生；由于肝脏MMP-9主要由枯否细胞产生，而蒿鳖养阴软坚方降低MMP-9的作用更强，这是否与其影响枯否细胞有关尚待研究。

参  考  文  献

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（收稿日期：2009-07-20）

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