蓝莓对肝纤维化大鼠血红素加氧酶1表达的影响

【摘要】目的  观察蓝莓对大鼠肝纤维化的预防作用及对血红素加氧酶-1（HO-1）表达的影响。 方法  45只SD大鼠随机分为生理盐水对照组（A组）、模型组（B组）、蓝莓汁预防组（C组）、丹芍化纤胶囊预防组（D组）及蓝莓汁加丹芍化纤胶囊预防组（E组），每组9只。CCl4复合因素制备大鼠肝纤维化模型，各预防组给予蓝莓汁或（和）丹芍化纤胶囊灌胃，共饲养8周。测定各组大鼠血清ALT水平及肝组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的表达，并进行肝组织病理学检查。采用实时荧光定量聚合酶链反应、免疫组织化学法和Western blot分析大鼠肝组织HO-1的mRNA及蛋白质表达。多组间数据比较用单因素方差分析，等级资料用秩和检验。 结果  B组大鼠血清ALT水平高于A组［（203.25±31.62）U/L比（57.25±6.88）U/L，F＝92.498，P<0.05）]，各预防组较B组明显减少[C、D和E组分别为（149.44±16.51）U/L、（136.88±10.07）U/L和（127.38±11.03）U/L，F＝92.498，P＜0.05）]。C、D、E组大鼠肝组织匀浆SOD水平分别为（1.36±0.09）U/mg、（1.42±0.13）U/mg、（1.50±0.15）U/mg，高于B组的（1.08±0.19）U/mg（F＝13.671，P<0.05）；MDA水平分别为（0.294±0.026）nmol/mg、（0.285±0.025）nmol/mg、（0.284±0.028）nmol/mg，低于B组的（0.335±0.056）nmol/mg（F＝20.809，P<0.05）。各预防组肝纤维化程度较B组也有所减轻（χ2＝24.956，P<0.05）。B组大鼠肝组织HO-1的mRNA和蛋白质表达高于A组（F值分别为4.549和22.926，P值均＜0.05），各预防组大鼠肝组织HO-1的mRNA和蛋白质表达均高于B组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论  蓝莓对CCl4所致大鼠肝纤维化有一定的预防作用；在慢性肝损伤时，蓝莓对HO-1的表达无明显影响。

【关键词】肝硬化； 血红素加氧酶-1； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 蓝莓

Effects of blueberry on the expression patterns of heme oxygenase-1 in rats with hepatic fibrosis    WANG Yu-ping, CHENG Ming-liang, ZHANG Bao-fang, WU Jun. Department of Infectious Diseases of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China

Corresponding author: CHENG Ming-liang, Email: chengml@ 21cn.com

【Abstract】 Objective    To study the protective effect of Blueberry against rat hepatic fibrosis and the effect of Blueberry on HO-1 expression patterns. Methods    A total of 45 SD rats were randomly divided into five groups namely control group (group A), model group (group B), blueberry group (group C), Dan-shao-hua-xian (DSHX) capsule group (group D) and blueberry +Dan-shao-hua-xian group (group E). Fibrous liver models in rats were induced by subcutaneous injection of CCl4 and high-lipid/low-protein diet for 8 weeks except the control group which accepted saline alone. The level of alanine aminotransferase (ALT) in serum was examined. The activities of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in liver homogenates were determined. by the xanthine oxidase method and the thiobarbituric acid method. The pathology of hepatic fibrosis was evaluated by hematoxylin and eosin (H&E) staining. The Expression of HO-1 was detected by real-time RT-PCR, immunohistochemical techniques and western blotting. Results    Serum ALT levels in every prevention group was lower than the group B [(149.44±16.51), (136.88±10.07), (127.38±11.03) vs (203.25±31.62) U/L, F = 92.498, P < 0.05], the SOD of liver homogenate in prevention group was significantly higher and the MDA was lower compared with the group B [SOD: (1.36±0.09), (1.42±0.13), (1.50±0.15) vs (1.08±0.19) U/mg, F = 13.671, P < 0.05; MDA: (0.294±0.026), (0.285±0.025), (0.284±0.028) vs (0.335±0.056) nmol/mg, F = 20.809, P < 0.05]. The pathological stages of hepatic fibrosis were all significantly reduced in prevention group (χ2 = 24.956, P < 0.05). Compared with group A, the mRNA and protein expressions of HO-1 were elevated (F = 4.549, 22.926, P < 0.05) in group B and increased in group C-E, but there is no significant difference existed. Conclusion    Blueberry may have preventive and protective effects on CCl4-induced hepatic fibrosis by reducing lipid peroxidation. However, these effects may not be related to the activation of HO-1 during long-term of CCl4.

【Key words】Liver cirrhosis; Heme oxygenase-1;  Superoxide dismutase;  Malondialdehyde;  Blueberry

氧化应激是肝纤维化的重要发病机制[1]。核转录相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是其调控的重要的抗氧化酶，能增加机体对氧化应激的抵抗性[2]。蓝莓是杜鹃花科越桔属，美国人类营养研究中心近年的研究结果表明，蓝莓中含有大量生理活性物质，被称为果蔬中“第一号抗氧化剂”[3-4]。本研究试图探讨蓝莓对大鼠肝纤维化的预防作用及对HO-1表达的影响。

材料与方法

一、材料 

1．蓝莓：兔眼品种，贵州省麻江县蓝莓生产基地提供，-20℃保存，临用时解冻榨汁。丹芍化纤胶囊由贵阳制药厂生产。

2．实验动物：清洁级雄性SD大鼠45只，体质量（250±20）g，由贵阳医学院实验动物中心提供，批号：SCXK（黔）2002-0001。自由饮水，室温15～25℃，自然采光。实验前适应环境1周，普通饲料喂养。

3．主要试剂：HO-1、β-肌动蛋白（actin）引物、SYBR GreenⅠ、10×PCR缓冲液Ⅱ、10mmol/L dNTP、50μmol/L Oligo dT、20U/μl RNase抑制剂、50U/μl MMLV（RNA反转录酶）及RNA纯化试剂盒均由美国国立卫生研究院癌症环境卫生研究所刘杰博士惠赠。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。HO-1第一抗体（SC-10789）和EnVision试剂盒购自丹麦Dako公司。碱性磷酸酶标记的第二抗体（SC-2030）、PVDF膜和电化学发光（ECL）试剂盒购自美国Millipore公司，胞质蛋白提取试剂盒和Bradford蛋白定量试剂盒购自南京凯基生物公司，预染蛋白质相对分子质量标准购自加拿大MBI公司，β-actin（A5441）购自美国Sigma公司。HO-1上、下游引物序列分别为5′-ATCATGGCTTGG CCTACATTG-3′和5′-CACGGATGTGCACCT CCTT-3′。β-actin上、下游引物序列分别为5′-TGACCGAGCGTGGCTACAG-3′和5′-GGGC AACATAGCACAGCTTCT-3′。

4．主要仪器：核酸定量仪购自美国Amersham公司，DA7600荧光定量PCR购自中山达安基因公司，高速低温离心机购自美国Thermo公司，显微图像采集系统购自日本Olympus公司，纯水仪购自英国Elga公司，垂直电泳槽及电转移仪购自北京六一仪器厂，Gel Doc EQ凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

二、方法

1．动物分组及处理：大鼠随机分为5组，即生理盐水对照组（A组）、模型组（B组）、蓝莓汁预防组（C组），丹芍化纤胶囊预防组（D组）以及蓝莓汁和丹芍化纤胶囊预防组（E组），每组9只。除正常组给予正常饮食外，其他大鼠用复合病因刺激制备肝纤维化模型[5]。模型制备：首剂为CCl4（浓度40%的CCl4，按2∶3的比例与花生油配制）4ml/kg皮下注射，每隔4d注射1次，以后剂量为3ml/kg，同时给予高脂饮食（79.5%玉米粉、20%猪油和0.5%胆固醇）。造模的同时，Ｃ、Ｄ及Ｅ组分别予以蓝莓汁（15g/kg）、丹芍化纤胶囊（1g/kg）[5]和蓝莓汁（15g/kg）＋丹芍化纤胶囊（1g/kg）灌胃，1次/d，共8周。8周后处死大鼠（各组动物分别存活8、8、9、8和8只），常规留取血清，采用Siemens Advia 1650全自动生物化学分析仪按试剂盒要求测定ALT的活性。制备肝组织匀浆，检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。每只大鼠取相同部位肝脏用4%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，观察肝脏病理变化并参照文献[6]进行分期。

2．逆转录和实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测HO-1转录水平：采用Trizol提取鼠肝组织总RNA，纯化柱纯化，用紫外分光光度法测定RNA的量，以260nm和280nm处吸光度值的比值（A260/A280）鉴定RNA纯度。分别取1000ng总RNA，经MMLV逆转录酶催化合成cDNA第一链，以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增，得出各样本的初始拷贝数。实验过程中以β-actin看家基因作为实时荧光RT-PCR的质控。每组样本一式2份，在指数期内，设定参数值，得到每个PCR反应的循环域（cycletkeshold，Ct）值，即模板cDNA经PCR扩增后达到某一荧光强度的循环次数。以每例组织标本的目的片段与带内参照片段的Ct比值作为该标本基因表达的相对数值，以对照组的表达量为100%，计算各预防组的表达量。

3. 免疫组织化学法和Western blot检测各组大鼠肝组织HO-1的表达：采用EnVision二步法，切片常规脱蜡，高压锅抗原热修复，滴加第一抗体（1∶100），4℃过夜，滴加第二抗体，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染。结果判定：以磷酸盐缓冲液代替第一抗体作为阴性对照，以小鼠脾脏组织阳性切片做阳性对照。光镜下观察，肝细胞和（或）间质细胞胞质染成棕黄色为阳性。每张切片随机选取5个高倍视野（×400），计数100个细胞中的阳性细胞百分比，间接估计表达量；按照试剂盒说明分别提取浆蛋白，Bradford法测定蛋白质含量。取等量的蛋白质样品40μg，用样品缓冲液处理，蛋白质变性后，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，电转移法将蛋白质转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1h，洗膜后加入HO-1抗体（1∶1000），4℃过夜，TBST洗膜后以辣根过氧化物酶标记的第二抗体（1∶5000）室温孵育1h，洗膜后用ECL试剂曝光显影，洗片后用Gel Doc EQ凝胶成像仪扫描，Quantity One软件分析结果。以β-actin表达水平作为内参照。

4．统计学处理：数据分析采用SPSS11.5统计软件。计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，分析前行方差齐性检验，方差齐时用SNK法（q检验）；方差不齐时用Tambane’s（q’检验）；等级资料用秩和检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. 血清ALT活性比较：B组ALT水平高于A组（F＝92.498，P<0.05），而各预防组（C、D及E组）比B组明显降低（F＝92.498，P<0.05），见图略。

2．肝组织匀浆中SOD及MDA活性比较：与A组比较，B组肝组织匀浆中的SOD明显降低，MDA明显增高，差异有统计学意义（F值分别为13.671和20.809，P值均<0.05）。与B组比较，C、D及E组肝组织匀浆中的SOD升高，MDA降低，差异有统计学意义（F值分别为13.671和20.809，P值均<0.05），见图略。

3．肝脏纤维化程度比较：HE染色结果显示：正常组大鼠肝脏组织结构正常，肝小叶以中央静脉为中心，肝细胞呈放射状排列，汇管区及肝组织内均无胶原纤维增生。肝纤维化大鼠肝实质广泛破坏，弥漫性纤维增生，小叶内结构紊乱；肝细胞弥漫性脂肪变性；有的形成纤维间隔，分割并破坏肝小叶，少部分病例甚至形成少量的假小叶，纤维间隔及汇管区见大量慢性炎症细胞浸润。预防组肝纤维化程度明显减轻（χ2＝24.956，P＜0.05），轻者主要表现为肝细胞弥漫性脂肪变性，无明显纤维化或仅在汇管区周围见少量纤维化。重者肝小叶结构大部分保留，有桥接纤维化形成，汇管区及纤维间隔少量慢性炎症细胞浸润。见表1及图3。

4．肝组织HO-1的mRNA和蛋白质表达比较：与A组相比，B、C、D和E组HO-1的mRNA和蛋白质表达均增高（F值分别为4.549和22.926，P值均＜0.05），以C组和E组较明显。C、D和E组HO-1的mRNA和蛋白质表达比B组增多，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表略和图略。

表1  各组不同肝纤维化分期的大鼠数量（只）

组别       动物数                  肝纤维化分期                     平均秩次

              S0   S1   S2   S3   S4  

A组       8     6     2     0     0     0       5.50

B组 8     0     0     0     4     4     34.25a

C组 9     0     2     3     3     1     23.67ab

D组       8     0     3     2     1     2     21.75ab

E组 8     0     3     3     2     0     19.50ab

  注：a 与A组比较，P＜0.05；b 与B组比较，P＜0.05

讨    论

蓝莓富含花青素等其他果品中少有的特殊成分，号称为果蔬中“第一号抗氧化剂”。从蓝莓叶子中提取的花青素具有抑制HCV的作用[7]。另外，其抗氧化作用对于恢复视力、改善大脑记记和智力、治疗糖尿病、抗癌等都有独特的功效[8-11]。

Nrf2是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，生理状态下它与胞质蛋白伴侣分子Kelch样环氧氯丙烷联合蛋白1结合，活性处于相对抑制状态。氧化应激源作用下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷联合蛋白1解偶连后转移入核，与抗氧化反应元件上GCTGAGTCA位点结合，启动抗氧化反应元件调控的第Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表达，增加细胞对氧化应激的抗性。HO-1是其重要的调控Ⅱ相酶，帮助细胞抵御氧化应激。HO-1因其应激性、可诱导性和对多种氧化损伤具有良好的保护效应，近年来备受关注，成为预防氧化攻击的首选靶基因之一[2,12]。在正常肝脏，HO-1主要存在于枯否细胞中，在应激状态或各种原因诱导的肝纤维化和肝硬化过程中，肝脏能够高水平表达HO-1，而且HO-1在肝实质细胞和间质细胞都有表达，为其广泛参与肝脏疾病的病理生理过程提供可能[13]。

口服姜黄素不仅仅能保护二甲基亚硝胺诱导的肝损伤，而且使鼠肝脏HO-1蛋白的表达和活性高度增加，HO-1的抑制剂锌-原卟啉Ⅸ能废除姜黄素对二甲基亚硝胺诱导肝损伤的保护作用。姜黄素的保肝作用在于其能诱导Nrf2与抗氧化反应元件结合，启动HO-1的表达[14]。楤木属根的乙醇抽提物对叔丁基-过氧化氢所致的肝毒性的保护作用是经由Nrf2信号途径的抗氧化酶HO-1起作用。我们的前期研究结果表明，蓝莓对CCl4所致大鼠急性肝损伤有保护作用[15]。同时也发现，用蓝莓汁灌胃3周后，可激活小鼠肝脏的Nrf2及其调控Ⅱ相酶HO-1和Nqo1的表达，因此我们进一步假设蓝莓对肝纤维化可能有预防作用，并且该预防作用可能与激活机体的Nrf2导致HO-1表达增多有关。

复方中药制剂丹芍化纤胶囊是由丹参、赤芍、汉防己、银杏等组成，有良好防治肝纤维化的作用，其抗纤维化机制可能与抑制肝细胞脂质过氧化和抑制肝星状细胞增殖等有关[16]。本实验结果表明，与模型组相比，蓝莓与丹芍化纤胶囊单用或合用均能降低大鼠血清的ALT活性，说明其对肝脏具有保护作用。大鼠肝组织匀浆中SOD水平的增加及MDA水平的降低，均表明其能抑制肝脏的脂质过氧化损伤。病理分期结果表明，蓝莓与丹芍化纤胶囊单用或合用均能有效减轻大鼠肝纤维化程度，提示其对预防大鼠肝纤维化具有一定的作用。而蓝莓与丹芍化纤胶囊合用与两者单用的效果差异无统计学意义，提示两者无明显的协同作用。本研究结果也显示，模型组HO-1的表达比正常组明显增高，而蓝莓汁单用或合用丹芍化纤预防组的HO-1表达均比模型组增加，但差异无统计学意义。

参  考  文  献

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（收稿日期：2010-02-09）

（本文编辑：黄晨）

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