醛酮还原酶1B10基因沉默对MHCC97H细胞生长和基因表达的影响

【摘要】目的  探讨醛酮还原酶1B10（AKR1B10）基因在肝癌发生和发展过程中的作用及其机制。 方法  化学合成AKR1B10序列特异性小干扰RNA，用脂质体LipofectamineTM2000介导转染人肝癌细胞系MHCC97H，设实验组转染AKR1B10-小干扰RNA，设阴性对照组转染非编码序列双链小RNA，设空白对照组不作转染。用实时定量PCR、Western blot和酶活性检测法检测AKR1B10 mRNA和蛋白的表达情况，用细胞计数试剂盒CCK-8检测转染细胞的生长增殖变化，用流式细胞仪检测膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶双标记的凋亡细胞变化，并用实时定量PCR检测c-myc、c-fos、N-ras、ki-67、caspas-3、bax肿瘤相关基因的表达变化。用析因设计的方差分析和完全随机方差分析进行组间比较，LSD法进行多重比较。 结果  转染24、48h和72h后，AKR1B10 mRNA的相对表达量在实验组分别为0.382±0.048、0.098±0.008和0.257±0.032；阴性对照组分别为0.797±0.092、0.742±0.086和0.794±0.105；空白对照组分别为0.808±0.118、0.716±0.083和0.706±0.067。不同转染时间和不同实验组中AKR1B10 mRNA的表达比较，F值分别为11.650和566.971，P值均＜0.01，差异均有统计学意义。转染24、48h和72h后，实验组的AKR1B10 mRNA表达较空白对照组被明显抑制，抑制率分别为52.7%±5.6%、86.3%±4.4% 和63.7%±6.1%，以转染48h的抑制率最高（t＝80.68，P＜0.01）；阴性对照组的表达水平接近空白对照组（P＞0.05）。Western blot结果显示，转染24、48h和72h后，实验组的AKR1B10蛋白表达水平均有下降，其中以转染72h的降低幅度最大；阴性对照组的表达水平接近空白对照组。转染24、48、72h和96h后，实验组450nm处吸光度值分别为1.465±0.040、1.724±0.106、1.934±0.069和2.377±0.163；阴性对照组分别为1.528±0.044、2.019±0.091、2.711±0.204、3.151±0.159；空白对照组分别为1.567±0.057、2.102±0.099、2.642±0.198、3.069±0.180；不同转染时间和不同实验组间比较，F值分别为128.092、36.535，P值均＜0.01，差异均有统计学意义。转染了AKR1B10-siRNA的MHCC97H细胞生长受到抑制。与空白对照组相比，实验组的细胞生长抑制率在转染48、72h和96h分别为18.0%±1.6%、26.6%±3.1%和22.7%±1.1%，t值分别为19.197、13.093和23.553，P值均＜0.01，差异均有统计学意义；阴性对照组的细胞生长未受到明显抑制（P＞0.05）。实验组、阴性对照组和空白对照组各基因mRNA的相对表达量：c-myc基因分别为1.047±0.156、1.737±0.193和1.631±0.128；c-fos基因分别为0.041±0.003、0.082±0.006和0.081±0.004；N-ras基因分别为0.082±0.009、0.156±0.013和0.133±0.015；ki-67基因分别为0.032±0.002、0.070±0.008和0.069±0.005；caspase-3基因分别为0.148±0.018、0.110±0.009和0.108±0.012；bax基因分别为0.780±0.092、0.629±0.058和0.617±0.073，各基因的mRNA在不同组别表达差异均有统计学意义（F值分别为104.384、400.915、211.903、427.041、67.750和37.272，P值均＜0.01）。 结论  AKR1B10可能通过调节肿瘤相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。

【关键词】癌，肝细胞； 基因； 转染； RNA干扰

Effects of AKR1B10 gene silence on the growth and gene expression of HCC cell line MHCC97H    WEI Wei*, LIANG Hong-jie, CUI Jie-feng, GUO Kun, KANG Xiao-nan, CAO Ji, SU Jian-jia, LI Yuan, LIU Yin-kun. *Cancer Hospital Affiliated to Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

Corresponding author: LI Yuan, Email: liyuangx@ yahoo.com.cn

Co-corresponding author: LIU Yin-kun, Email: liu.yinkun@ zs-hospital.sh.cn, Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai 200032, China

【Abstract】 Objective    To explore the biological function and possible underlying mechanism of aldo-keto reductase family 1 member B10 (AKR1B10) gene during hepatocarcinogenesis. Methods    A pair of chemically synthesized small interfering RNA (siRNA) targeting on AKR1B10 was transfected into liver cancer cell line MHCC97H by LipofectamineTM 2000. After confirming the interfering effects of AKR1B10-siRNAs through Quant SYBR Green polymerase chain reaction (Real-time PCR), Western blot and enzymatic activity assay, the capabilities of proliferation and apoptosis of the transfected cells were observed by CCK-8 assay and flow cytometry analysis, and the expressions of a group of tumor-related gene such as c-myc, c-fos, N-ras were observed through Real-time PCR. Results    The expressions of AKR1B10 and the enzymatic activity were down-regulated significantly in AKR1B10-siRNA-transfected cells. Compared with mock and blank control groups, cell growth in AKR1B10-siRNA-transfected group was inhibited by 26.6%±3.1% at 72h after transfection. The ratio of apoptotic cells was 37.3%±1.0% in AKR1B10-siRNA-transfected group, which was significantly higher than that in mock and blank control groups (P < 0.01). Real-time PCR showed that the expressions of oncogene c-myc, c-fos and N-ras, and the proliferation-associated gene ki-67 were down-regulated in AKR1B10-siRNA-transfected cells, while the expressions of apoptosis-promoting gene caspas-3 and bax were up-regulated. Conclusions    AKR1B10 might promote proliferation, inhibit apoptosis and then induce malignant transformation of hepatocytes by regulating the expression level of some tumor-related genes.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Genes; Transfection; RNA interference

醛酮还原酶1B10 (aldo-keto reductase family 1 member B10，AKR1B10)是细胞质内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依赖的可溶性单体氧化还原酶，属于醛酮还原酶超家族中的一员[1]。 AKR1B10在化学致癌物诱导的大鼠肝癌及人类肝癌细胞中高表达。我们曾经用比较蛋白质组织化学技术对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中的差异表达蛋白进行了动态观察，筛选出一批与肝癌发生和发展有关的差异表达蛋白，其中AKR1B10蛋白表达水平在大鼠肝癌形成过程中呈逐步升高的趋势[2]。本研究采用RNA干扰技术，观察AKR1B10表达被抑制后对MHCC97H细胞的肿瘤相关生物学功能的影响，以探讨AKR1B10在肝癌形成中的作用及其机制。

材料与方法

一、材料

人肝癌细胞系MHCC97H由上海复旦大学医学院附属中山医院肝癌研究所保存；DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Gibco BRL公司；Trizol和脂质体2000转染试剂均购自美国英杰公司；逆转录试剂盒、10mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷、Taq DNA聚合酶均购自加拿大富酶泰斯公司；荧光定量Quant SYBR Green PCR试剂盒购自北京天根公司；细胞裂解液和BCA法蛋白浓度检测试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司；聚偏氟乙烯膜购自美国密理博公司；增强化学发光试剂盒购自美国Pierce公司；小鼠抗人AKR1B10抗体购自台湾Abnova公司；小鼠抗人3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）由上海康城公司分装；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠第二抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；DL-甘油醛、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸均购自美国Sigma公司；胞计数试剂盒（CCK-8）购自日本同仁化学研究所；膜联蛋白（Annexin）Ⅴ-异硫氰酸荧光素凋亡试剂盒购自美国BIPEC Biopharma公司。

二、方法

1. 小干扰（si）RNA序列：针对人类AKR1B10基因的siRNA和阴性对照双链小RNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，AKR1B10-siRNA序列参照Yan等[3]的报道，正义链为5′-CGAGAAUC GAGGUGCUGUUtt-3′，反义链为5′-AACAG CACCUCGAUUCUCGtt-3′；阴性对照双链小RNA正义链为5′-UUCUCCGAACGUGUCAC GUtt-3′，反义链为5′-ACGUGACACGUUCGG AGAAtt-3′。

2. 细胞培养及转染：人肝癌细胞MHCC97H贴壁生长于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃、5% CO2的细胞培养箱内传代培养；将处于对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，用不含抗生素的DMEM培养基稀释细胞后，以3×105个/孔接种于6孔板；培养24h至细胞的融合率达60%～70%，按lipofectamineTM 2000试剂使用说明书进行转染。设实验组转染AKR1B10-siRNA，设阴性对照组转染非编码序列双链小RNA，设空白对照组除不作转染外，其余处理与以上各组相同。转染浓度为150nmol/L；每组设3个平行孔；摇匀后置37℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育。

3. 干扰效果的鉴定：(1)实时定量PCR：分别于转染后24、48h和72h提取细胞总RNA，按照Trizol试剂说明书进行操作；检测细胞总RNA浓度；取2μg总RNA逆转录合成cDNA。引物序列：AKR1B10正义链为5′-CCCAAAGATGATAAAG GTAATGCCATCGGT-3′，反义链为5′-CGAT CTGGAAGTGGCTGAAATTGGAGA-3′（133bp）；看家基因GAPDH正义链为5′-ATG ACCCCTTCATTGACC-3′，反义链为5′-GAAGA TGGTGATGGGATTTC-3′（131bp）。实时定量 PCR按Quant SYBR Green PCR试剂盒说明书操作，每例样品AKR1B10基因和GAPDH基因各3个平行管，用iQTM 5 Multicolor实时荧光定量基因扩增仪（购自美国Bio-Rad公司）进行扩增。反应条件：94℃ 60s，94℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 60s，共45个循环。读取Ct值（荧光到达阀值时所需的PCR循环数），参照文献[4]报道的比较阈值法进行计算：首先按公式ΔCt＝Ct平均值（AKR1B10）－Ct平均值（GAPDH）分别计算各组的ΔCt，用2-ΔCt代表AKR1B10 mRNA的表达量，按公式抑制率＝(1－2-ΔCT)×100%（ΔΔCt＝ΔCt实验组－ΔCt空白对照组）计算AKR1B10基因表达抑制率。（2）Western blot检测：分别于转染后24、48h和72h收集细胞，加入细胞裂解液，于4℃、12000r/min离心30min，提取各组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。以总蛋白量30μg/孔进行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白后，将蛋白质以10V稳压电转移至聚偏氟乙烯膜；5%脱脂奶粉封闭后加入第一抗体，AKR1B10工作浓度为1∶300；GAPDH工作浓度为1∶5000，4℃孵育过夜；洗涤，加辣根过氧化物酶标记的第二抗体工作浓度为1∶10000，室温孵育1h；洗涤后用增强化学发光试剂于暗室曝光显影。（3）AKR1B10酶活性的检测：通过测定烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在340nm处吸光度值的下降来间接反应AKR1B10的活性，分别于转染后24、48h和72h收集细胞，提取各组细胞总蛋白检测蛋白浓度，调整细胞蛋白浓度为5μg/μl；将10μl细胞总蛋白加至总量为4ml的135mmol/L磷酸盐缓冲液、0.4mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，1.0mmol/L β-巯基乙醇、50mmol/L氯化钾和20mmol/LDL-甘油醛组成的酶反应体系中，混匀；取150μl加入96孔板，35℃反应20min；在Multisran Spectrum酶标仪（购自美国Thermo公司）上读取各孔340nm处吸光度(A340)值，计算各组蛋白20min内A340的下降值，按公式抑制率= (A阴性对照－ARNA干扰)/A阴性对照×100%计算AKR1B10酶活性的抑制率[3]。

4. CCK-8测定细胞增殖：细胞以1×104个/孔接种于96孔培养板，培养过夜后转染。除阴性对照组、空白对照组、实验组外，另设无细胞仅有培养液的空白组；每组设6个复孔。培养24、48、72h和96h后，每孔加入CCK-8溶液10μl；37℃培养箱中继续温育4h。用酶标仪读取各孔在450nm的吸光度（A450）值，参比波长630nm。按公式抑制率＝[(A阴性对照组-A空白组)－(A实验组－A空白组)]/(A阴性对照组－A空白组) ×100%计算细胞生长抑制率；以各时间点的抑制率绘制细胞生长抑制曲线。

5. 流式细胞仪检测细胞凋亡：应用Annexin Ⅴ/碘化丙啶（PI）双染法通过流式细胞仪检测转染细胞的凋亡情况。在无菌6孔培养板进行细胞转染，48h后收集细胞，500×g离心10min，弃上清液，冰磷酸盐缓冲液洗后悬浮于400μl结合缓冲液，加入5μl异硫氰酸荧光素标记的AnnexinⅤ，混匀，室温下避光孵育15min，每管加入10μl PI，避光孵育5min，用流式细胞仪检测。用TreeStar FlowJo 7.5.3 软件进行数据处理。

6. 实时定量PCR检测肿瘤相关基因的mRNA表达水平：转染后48h提取细胞总RNA进行逆转录，用实时定量PCR法检测肿瘤相关基因的表达。引物序列如下：c-myc基因正义链为5′-CTCCTCA CAGCCCACT-3′，反义链为5′-ACTGTCCAACT TGACCC-3′（产物为119bp）；c-fos基因正义链为5′-CAGGGCTGGCGTTGTGA-3′，反义链为5′-CGGTTGCGGCATTTGG-3′（产物为150bp）；N-ras基因正义链为5′-AAACAAGCCCACGAAC-3′，反义链为5′-CATGGCAATCCCATAC-3′（产物为176bp）；caspase-3基因正义链为5′-ACTGGAA TGACATCTCGGTCTG-3′，反义链为5′-CATCAATTCCACAATTTCTTCACGT-3′（产物为126bp）；bax基因正义链为5′-AGAGGA TGATTGCCGCCGT-3′，反义链为5′-CAACCA CCCTGGTCTTGGATC-3′（产物为243bp）；ki-67基因：正义链为5′-AGAGCTTCACAGCCAGA CCTAG-3′，反义链为5′-TGATGGCGTTTGT TTCCTAAAT-3′（产物为120bp）。

7. 统计学处理：用SPSS13.0软件对数据进行统计学处理。检测结果用均数±标准差（x-±s）表示。采用析因设计的方差分析和完全随机方差分析进行组间比较，LSD法进行多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. AKR1B10-siRNA对人肝癌细胞MHCC97H表达AKR1B10的影响：转染24、48h和72h后，实验组AKR1B10 mRNA的相对表达量分别为0.382±0.048、0.098±0.008和0.257±0.032；阴性对照组分别为0.797±0.092、0.742±0.086和0.794±0.105；空白对照组分别为0.808±0.118、0.716±0.083和0.706±0.067，不同转染时间和不同组中AKR1B10 mRNA的表达量比较，F值分别为11.650和566.971，P值均＜0.01，差异均有统计学意义。与空白组比较，转染24、48h和72h后，实验组的AKR1B10 mRNA表达被明显抑制，抑制率分别为52.7%±5.6%、86.3%±4.4%和63.7%±6.1%，以转染48h的抑制率最高（t＝80.68，P＜0.01）。Western blot结果显示，转染24、48h和72h后，实验组的AKR1B10蛋白表达水平均有下降，其中以转染72h的降低幅度最大；阴性对照组的表达水平接近空白对照组，见图略。不同时间与不同组别的AKR1B10 A340下降值比较，F值分别为91.074、16.108，P值均＜0.01，差异均有统计学意义，组别和时间无交互作用（F＝2.654，P＝0.141）。转染72h后实验组AKR1B10 A340下降值与空白对照组比较，t＝27.265，P＝0.001，差异有统计学意义，见表略。

2. AKR1B10-siRNA对MHCC97H细胞生长的影响：不同组别、时间的MHCC97H细胞A450值比较，F值分别为36.535和128.092，P值均＜0.01，差异均有统计学意义，组别和时间无交互作用（F＝2.351，P＝0.176）。转染48、72h和96h后，实验组细胞A450值与空白对照组比较，t值分别为19.197、13.093、23.553，P值均＜0.01，差异均有统计学意义，见表略。                                                                                                                                 

3. AKR1B10-siRNA对人肝癌细胞MHCC97H凋亡的影响：AnnexinⅤ染色结果显示的早期凋亡率在实验组、阴性对照组和空白对照组分别为6.3%±1.3%,1.4%±0.2%和1.0%±0.2%，AnnexinⅤ/PI双染色显示的晚期凋亡率分别为31.0%±2.7%、3.8%±0.1%和4.6%±0.1%。3组早期和晚期凋亡率比较，F值分别为43.230，296.866，P值均＜0.01，差异均有统计学意义，其中实验组凋亡率高于空白对照组（t＝105.254，P＜0.01）；阴性对照组和空白对照组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），见图略。

4. AKR1B10-siRNA对MHCC97H细胞的肿瘤相关基因表达水平的影响：实验组、阴性对照组和空白对照组的c-myc基因mRNA相对表达量分别为1.047±0.156、1.737±0.193和1.631±0.128；c-fos基因分别为0.041±0.003、0.082±0.006和0.081±0.004；N-ras基因分别为0.082±0.009、0.156±0.013和0.133±0.015；ki-67基因分别为0.032±0.002、0.070±0.008和0.069±0.005；caspase-3基因分别为0.148±0.018、0.110±0.009和0.108±0.012；bax基因分别为0.780±0.092、0.629±0.058和0.617±0.073，各基因的mRNA在不同组别表达差异均有统计学意义（F值分别为104.384、400.915、211.903、427.041、67.750和37.272，P值均＜0.01）。多重比较显示，实验组的癌基因c-myc、c-fos、N-ras和增殖相关基因ki-67的mRNA表达水平下降，表达量分别为空白对照组的64.2%±4.7%、50.5%±3.3%、61.7%±1.9%和46.4%±3.6%（t值分别为10.458、19.868、11.598和26.806，P值均＜0.01）差异均有统计学意义；而促凋亡基因caspase-3和bax的mRNA表达水平上调，表达量分别为空白对照组的137.3%±6.3%和126.5%±6.0%，t值分别为-5.041、-8.262，P值均＜0.01，差异有统计学意义。这些基因的mRNA表达水平在阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义。

讨    论

醛酮还原酶类是广泛存在于原核生物界和真核生物界的基因超家族，属药物、外源性物质和致癌物的Ⅰ相代谢酶。AKR1B10是超家族中醛糖还原酶亚家族中的一员，主要存在于结肠、小肠和肾上腺，在肝脏、甲状腺、前列腺和睾丸中低表达[5]。近年来，AKR1B10与肿瘤的关系日益受到重视，已有研究报道在肝癌、与吸烟相关的非小细胞肺癌、子宫颈癌和子宫内膜癌中检测到AKR1B10的异常表达[6-8]，还有研究者报道AKR1B10的异常表达存在于某些癌前病变中[9-10]。进一步研究发现非小细胞肺癌中AKR1B10与ki-67基因的表达水平呈正相关[7]；过表达AKR1B10的人胚肾细胞293T的克隆形成能力增强[11]。Yan等[3]发现AKR1B10可能参与调节细胞增殖和对反应性羰基的易感性。然而，迄今鲜见AKR1B10与肝癌发生和发展关系的相关报道。

对于基因功能的研究，一般的研究策略是改变目的基因的表达水平后观测其所导致的相关生物学行为改变。RNA干扰是由双链RNA诱发基因沉默，主要效应物是siRNA，直接转染合成的siRNA能特异性地抑制哺乳动物细胞内同源基因的表达[12]。本研究用化学合成针对AKR1B10的特异性siRNA转染人肝癌细胞MHCC97H，确认AKR1B10的表达被抑制后，观察MHCC97H细胞在增殖、凋亡等肿瘤相关生物学行为方面的改变，探讨AKR1B10在肝癌形成中的作用。研究结果显示AKR1B10表达明显下调的MHCC97H细胞生长受到抑制，凋亡率升高，提示AKR1B10可能通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡在肝癌形成过程中发挥作用。

最近的研究发现AKR1B10基因的转录起始位点在ATG翻译起始编码的上游，启动子上包含多个潜在的致癌和抑癌基因的结合位点，推测AKR1B10的表达可能受到肿瘤相关基因的调节；反之， AKR1B10也可能通过影响这些基因的表达从而在肿瘤形成中发挥作用[13]。本研究探讨了干扰AKR1B10表达后对MHCC97H细胞中肿瘤相关基因表达水平的影响，结果显示AKR1B10表达被抑制后，MHCC97H细胞的癌基因c-myc、c-fos、N-ras和增殖相关基因ki-67的mRNA表达水平下降，而促凋亡基因caspase-3和bax表达上调，提示AKR1B10可能通过影响这些基因的表达来参与调控细胞增殖和凋亡，导致肝细胞的恶性转化。

参  考  文  献

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(收稿日期：2009-12-20)

（本文编辑：孙宇航）

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