落新妇甙对热缺血再灌注损伤肝脏肿瘤坏死因子α与白细胞介素10表达的影响

【摘要】目的  观察落新妇甙对热缺血再灌注（I/R）损伤肝脏Th1、Th2型细胞因子表达的影响。 方法  C57BL/6小鼠随机分为4组：假手术组、模型组、落新妇甙小剂量（10mg/kg）干预组和大剂量（40mg/kg）干预组。干预组小鼠于缺血前24h和1h分别给予10mg/kg或40mg/kg的落新妇甙腹腔注射，建立70%部分肝I/R模型。收集肝组织标本，Western blot检测肝组织中肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）-10蛋白含量，RT-PCR检测肝组织TNFα、IL-10 mRNA的水平。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。 结果  与I/R模型对照组比较，小、大剂量落新妇甙干预组肝组织中TNFα蛋白表达水平依次降低，与TNFα mRNA的半定量RT-PCR结果相符（相对表达量分别为1.74±0.12与1.56±0.09、0.82±0.12，P值均＜0.05）；而IL-10蛋白表达水平依次升高，与IL-10 mRNA的半定量RT-PCR结果相符（相对表达量分别为0.96±0.08与1.11±0.17、1.47±0.08，P值均＜0.05）。 结论  落新妇甙干预能抑制I/R损伤肝组织中Th1型细胞因子TNFα的高表达，同时促进Th2型细胞因子IL-10的表达。

【关键词】肝； 缺血； 再灌注损伤； 白细胞介素-10； 肿瘤坏死因子α； 落新妇甙

Effects of astilbin on the expression of TNFα and IL-10 in liver warm ischemia-reperfusion injury   LIN Rong-kai*, ZHANG Cheng-hua, MU Ning, YAO Qing-yong, DONG Shao-liang, AI Qiu-bao, WANG Quan-xing. *Center of Liver Transplantation, the 180 Hospital of PLA, Quanzhou Fujian 362000, China 

Email: lrk7618401@163.com

【Abstract】 Objective    To investigate the effects of astilbin on the expressions of TNFα and IL-10 during liver warm ischemia-reperfusion injury. Methods    C57BL/ 6 mice were randomly divided into 4 groups (n = 8): sham-operated group (Sham), model control group(I/R), low dosage of astilbin treatment group (10 mg/kg) and high dosage of astilbin (40 mg/kg) treatment group. The treatment group mice were intraperitoneally injected with 10 or 40 mg/kg astilbin 24 hours and one hour before Ischemia, the hepatic ischemia-reperfusion model were thus established. After jn90 of min ischemia and 6 h reperfusion of the partial hepatic lobe, the expressions of TNFα and IL-10 in liver tissues collected from the experimental groups were detected by Western blot and semiquantitative RT-PCR. Results   The expression of TNFα protein in liver tissues gradually decreased in treatment groups (low and high dosages of astilbin treatment groups) as compared to the I/R model control group. Similar results were observed in the mRNA expressions of these genes as determined by semiquantitative RT-PCR (P < 0.05 for low dosage group; P < 0.01 for high dosage group). Compared with the I/R model control group, the expression of IL-10 was increased in both treatment groups (low dosage group P < 0.05; large dosage group P < 0.01). Conclusion    Treatment with astilbin decreases TNFα  expression but induces IL-10 expression in liver during warm ischemia-reperfusion injury.

【Key words】Liver;  Ischemia;  Reperfusion injury;  Interlukin-10;  Tumor necrosis factor α;   Astilbin

肝脏是对缺血再灌注损伤最敏感的器官之一。肿瘤坏死因子（TNF）α在缺血再灌注损伤的早期起着重要作用，能够诱导黏附分子在内皮细胞和白细胞上高表达，导致中性粒细胞产生更多氧自由基，诱导肝细胞的坏死和凋亡[1-2]。白细胞介素（IL）-10是较强的炎症抑制细胞因子，在许多缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，I/R）模型中都能观察到IL-10的抑制炎症、保护组织的作用，包括肝脏[3-4]。落新妇甙（astilbin）是从土茯苓的乙醇提取液中分离得到的3个二氢黄酮醇甙之一。研究证实其具有利尿、镇痛、抗炎及减轻心肌细胞缺血再灌注损伤的作用[5]。在刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）诱导肝炎后，落新妇甙能够显著降低TNFα的表达和肝脏枯否细胞的增殖[6]。在接触性皮炎动物模型中，它能显著促进IL-10的表达，减轻炎症反应[7]。而其在I/R肝脏中对上述细胞因子表达的影响尚鲜见报道。本研究采用小鼠部分肝脏热I/R模型观察落新妇甙对I/R肝脏TNFα、IL-10表达的影响。

材料与方法

1. 主要材料：分析纯落新妇甙粉剂购自杭州华东医药有限责任公司。实验中落新妇甙粉剂首先用二甲基亚砜溶解（40mg/ml），使用时用等渗盐水稀释至所需浓度。戊巴比妥钠购自上海国药集团化学试剂有限公司。抗小鼠TNFα、IL-10单克隆抗体购自美国SBA公司；抗β-肌动蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司；羊抗鼠IgG第二抗体购自美国KPL公司。SuperSignal West Femto超敏底物购自美国Pierce公司；BCA法蛋白质浓度检测试剂盒购自凯基公司；Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司；RNA PCR kit（AMV）Ver3.0试剂盒购自日本TaKaRa公司；DNA相对分子质量标准购自宝生物工程（大连）有限公司。

2. 动物分组及处理：清洁级雄性C57BL/6小鼠，体质量22～25g，购自第二军医大学实验动物中心。动物分笼饲养于第二军医大学免疫教研室，提供标准饮食。动物实验遵守学校及实验室相应的动物实验有关规定。随机分为4组（每组8只）：假手术组、I/R模型组、落新妇甙小剂量（10mg/kg）干预组、落新妇甙大剂量（40mg/kg）干预组。于缺血前24h和1h分别对落新妇甙干预组小鼠腹腔注射10mg/kg或40mg/kg的落新妇甙，I/R模型组和假手术组小鼠给予等体积等渗盐水。再灌注时干预组经尾静脉注射分别给予等剂量落新妇甙，模型组和假手术组同样给予等体积等渗盐水。

3. 建立动物模型：采用70%部分肝脏I/R模型，按Zhai等[8]报道的方法操作。

4. 肝组织样品准备：缺血90min，再灌注6h后各实验组小鼠左叶肝组织取样，于液氮保存，用于Western blot及RT-PCR分析。

5. Western blot检测肝组织TNFα、IL-10蛋白表达：取各组冻存的缺血90min、再灌注6h肝组织100mg，用研钵粉碎组织块，按照3ml/g加入RIPA缓冲液及苯甲基磺酰氟，以12000r/min 4℃离心30min；收集上清液，按照凯基公司BCA法蛋白质浓度检测试剂盒说明书操作进行蛋白质定量，空白对照采用RIPA缓冲液。调整各组样品蛋白质浓度至一致，常规电泳、转膜、封闭。按说明书要求加入第一抗体、第二抗体；将Western blot发光检测试剂中的A液和B液等体积混匀，室温孵育5min，于凝胶成像分析检测仪上进行检测。

6. 半定量RT-PCR检测肝组织TNFα、IL-10 mRNA表达：（1）总RNA的抽提与纯度鉴定：取各组冻存的小鼠肝组织100mg。按Trizol试剂盒说明书进行抽提。在紫外分光光度仪波长260nm和280nm处测吸光度（A）值，计算A260/A280的比值，鉴定mRNA浓度和纯度;根据所测浓度加入DEPC水稀释成0.5g/L浓度，-80℃保存。（2）RT-PCR：用TaKaRa公司RT-PCR扩增试剂盒扩增目的基因。查询GenBank序列库，各基因引物序列：TNFα正义引物为5′-GTCGTAGCAAACCACCAAG-3′，反义引物为5′-GTCCAGATGAAACCTCAGT-3′；β-肌动蛋白正义引物为5′-AGTGTGACGTTGAC ATCCGT-3′，反义引物为5′-GCAGCTCAGTAA CAGTCCGC-3′；IL-10正义引物为5′-GCTCTTA CTGACTGGCATGAG-3′；反义引物为5′-GGCCT TGTAGACACCTTGGT-3′。引物合成由上海生工生物工程技术公司完成。TNFα PCR反应条件：94℃ 2min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 10min。TNFα扩增片段为415bp。IL-10 PCR反应条件：94℃ 2min；94℃ 30s，56℃ 30s，72 ℃ 1min，共35个循环；72℃ 10min。IL-10扩增片段为442bp。（3）电泳及扩增产物成像分析：取PCR产物9μl，加入1μl含溴酚蓝指示剂的缓冲液（10×）混匀，置于12g/L琼脂糖凝胶中，稳定电压80V，电泳1h。紫外透射仪下查看，再用Gel-Pro IMAGER 60-2517型成像分析系统进行分析，测定各条带A值；计算各产物与β-肌动蛋白的A值比值，即为目的RNA的相对表达量。计算公式：目的条带相对量=产物电泳条带A值/β-肌动蛋白产物电泳条带A值。

7. 统计学分析：实验数据以均数±标准差（x-±s）表示。采用SSPS10.0软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. 落新妇甙对肝组织TNFα蛋白表达的影响：Western blot检测肝组织中TNFα蛋白水平的表达，结果显示：I/R模型对照组与假手术组比较，TNFα表达明显增强；落新妇甙小、大剂量干预后，TNFα表达渐次减弱（图略）。

2. 落新妇甙对肝组织TNFα mRNA表达的影响：半定量结果显示，I/R模型对照组（1.74±0.12）TNFα mRNA表达较假手术组（0.81±0.10）明显增强；与I/R模型对照组比较，落新妇甙小剂量干预能降低TNFα mRNA表达水平（1.56±0.09，P＜0.05），大剂量则明显降低（0.82±0.12，P＜0.01）（图略，表略）。

3. 落新妇甙对肝组织IL-10蛋白表达的影响：Western blot检测肝组织中IL-10蛋白的表达，结果显示：与I/R模型对照组比较，落新妇甙小、大剂量干预后，IL-10表达渐次增强（图略）。

4. 落新妇甙对肝组织IL-10 mRNA表达的影响：半定量结果显示，假手术组IL-10 mRNA表达水平较低（0.43±0.07），与I/R模型对照组比较（0.96±0.08），落新妇甙小剂量干预能上调IL-10 mRNA表达（1.11 ±0.17，P＜0.05），大剂量则明显促进IL-10 mRNA表达（1.47±0.08，P＜0.01）（图略，表略）。

讨    论

I/R是肝移植不可避免的过程，可导致急性炎症反应并由此引起器官的严重损伤和功能丧失。最大限度地减轻I/R不但可以增加供体，还可以使更多的患者通过肝移植手术获得康复。而实现这一愿望的首要步骤就是更加充分地理解I/R损伤的机制。

TNFα是细胞因子家族中最强效的炎症介质， 它可通过上调血管内皮细胞黏附分子、促进炎性介质激活白细胞、刺激中性粒细胞释放超氧阴离子、激活巨噬细胞释放IL-1与6等机制在缺血再灌注过程中对移植肝发挥作用[9]。通过干预TNFα的产生和活化，可以达到减轻肝I/R的目的。缺血前用抗TNFα单克隆抗体中和TNFα能减少肝细胞凋亡、减轻I/R[10]。与正常鼠I/R程度比较，TNFα基因敲除(TNFα-/-)小鼠I/R时血清中ALT含量显著下降，缺血肝脏的坏死程度明显减轻，而缺血前给与低剂量的TNFα可使TNFα基因敲除小鼠恢复I/R[11]。在刀豆球蛋白A诱导肝炎的模型中，落新妇甙能够显著抑制肝脏枯否细胞的增殖，降低血清和体外脾脏淋巴细胞的TNFα表达，减轻肝脏损伤[6]。本研究中，我们也观察到落新妇甙干预能显著降低I/R引起的TNFα在肝组织中的高表达，并且RT-PCR结果也进一步证实落新妇甙干预能有效抑制I/R引起的TNFα mRNA在肝组织中的高表达，并呈剂量-效应表现，从而减轻由TNFα介导的进一步损伤。

IL-10是公认的抑制炎症细胞因子，可抑制单核细胞依赖性Th细胞增殖，并抑制Th1类细胞因子的合成及其活性。其抑制炎症反应的机制是通过抑制CD3+和CD4+ T淋巴细胞上核因子-κB的活性实现的[4]；而且IL-10能够激活STAT3信号途径，后者对抑制巨噬细胞活化具有重要作用。Dinant等[12]用重组大鼠IL-10在大鼠肝I/R模型中观察到明显的保护作用，同时发现IL-10能促进部分肝切除后的肝再生；Ke等[13]用腺病毒转染病毒IL-10基因，干扰TLR4和HO-1信号通路，在小鼠肝I/R模型中观察到损伤明显减轻，TLR4和NF-κB表达明显受抑制，抗氧化剂HO-1和抗凋亡的Bcl-2/Bcl-xL表达得到加强。本研究中也观察到落新妇甙干预能够明显上调小鼠部分热I/R肝脏组织中IL-10在蛋白和mRNA水平的表达，说明落新妇甙可能通过上调IL-10表达产生抑制炎症反应的作用。

参  考  文  献

[1]Hsu YC, Chou TY, Chen CF, et al. Rat liver ischemia/reperfusion induced proinflammatory mediator and antioxidant expressions analyzed by gene chips and real-time polymerase chain reactions. Transplant Proc, 2008, 40: 2156-2158.

[2]Streetz K, Leifeld L, Grundmann D, et al. Tumor necrosis factor alpha in the pathogenesis of human and murine fulminant hepatic failure. Gastroenterology, 2000, 119: 446-460.

[3]Li JQ, Qi HZ, He ZJ, et al. Cytoprotective effects of human interleukin-10 gene transfer against necrosis and apoptosis induced by hepatic cold ischemia/reperfusion injury. J Surg Res, 2009, 157: e71-78.

[4]Tilney NL, Guttmann RD. Effects of initial ischemia/reperfusion injury on the transplanted kidney. Transplantation, 1997, 64: 945-947.

[5]Gao SH, Pan TC. Protective effects of astilbin on rat isolated heart reperfusion injury. Zhonghua Shiyong Zhongxiyi Zazhi, 2003, 3: 1693-1694. (in Chinese)

高思海,潘铁成.落新妇甙的提取及对心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究.中华实用中西医杂志,2003,3:1693-1694.

[6]Wang J, Zhao Y, Xu Q. Astilbin prevents concanavalin A-induced liver injury by reducing TNF-a production and T lymphocyte adhesion. JPP, 2004, 56: 495-502.

[7]Fei M, Wu X, Xu Q. Astilbin inhibits contact hypersensitivity through negative cytokine regulation distinct from cyclosporin A. J Allergy Clin Immunol, 2005, 116: 1350-1356.

[8]Zhai Y, Shen XD, O扖onnell R, et al.Cutting edge: TLR4 activation mediates liver ischemia/reperfusion inflammatory response via IFN regulatory factor 3-dependent MyD88-independent pathway. J Immunol, 2004, 173: 7115-7119.

[9]Pryhuber GS, Huyck HL, Roper JM, et al. Acute tumor necrosis factor-alpha-induced liver injury in the absence of tumor necrosis factor receptor-associated factor 1 gene expression. Am J Pathol, 2005, 166: 1637-1645.

[10]Ben-Ari Z, Hochhauser E, Burstein I, et al. Role of anti-tumor necrosis factor-alpha in ischemia/reperfusion injury in isolated rat liver in a blood-free environment. Transplantation, 2002, 73: 1875-1880.

[11]Teoh N, Field J, Sutton J, et al. Dual role of tumor necrosis factor-alpha in hepatic ischemia-reperfusion injury: studies in tumor necrosis factor-alpha gene knockout mice. Hepatology, 2004, 39: 412-421.

[12]Dinant S, Vetel鋓nen RL, Florquin S, et al. IL-10 attenuates hepatic I/R injury and promotes hepatocyte proliferation. J Surg Res, 2007, 141: 176-182.

[13]Ke B, Shen XD, Tsuchihashi S, et al. Viral interleukin-10 gene transfer prevents liver ischemia-reperfusion injury: Toll-like receptor-4 and heme oxygenase-1 signaling in innate and adaptive immunity. Hum Gene Ther, 2007, 18: 355-366.

(收稿日期：2009-09-20)

(本文编辑：朱红梅)

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