大豆异黄酮对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

【关键词】  肝； 缺血； 再灌注损伤； 肿瘤坏死因子α； 白细胞介素-1； 大豆素

The protective effects of soybean isoflavone against hepatic ischemia-reperfusion injury in rat    PENG Ci-jun, FENG Zan-jie.

【Key words】Liver; Ischemia; Reperfusion injury; Tumor necrosis factor alpha; Interlukin-1; Daidzein

【First author’s address】Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi Guizhou Province 563003, China

Email: pengcijun@ gmail.com

肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）的机制尚未阐明，可能与活性氧（ROS）生成、细胞因子参与、肝细胞内钙离子超载、细胞凋亡等有关[1]。大豆异黄酮（SI）是人们公认的抗氧化剂及抗炎药物。研究结果表明，其对心肌、脑等器官缺血再灌注损伤具有保护作用[2-3]。但对HIRI是否具有保护效应，鲜见报道。本研究通过动物实验观察了SI对HIRI的保护作用。

一、材料与方法

1. 材料：SI（纯度40%）购自中国天津市康宁生物化学工程有限公司。ROS、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）检测试剂盒购自中国南京建成生物制品有限公司，肿瘤坏死因子（TNF）α及白细胞介素（IL）-1酶联免疫吸附法检测试剂盒购自中国晶美生物工程公司。

2. 动物分组及用药：将50只Wistar大鼠（购自第三军医大学动物实验中心）随机分成5组：假手术组，缺血再灌注（IR）组和低、中、高剂量SI干预（SI1、SI2、SI3）组，每组10只。SI1、SI2、SI3组每天分别灌胃10、20、60mg/kg的SI（分别相当于SI建议人使用量的5、10、30倍），假手术组和IR组灌以等量等渗盐水，持续灌胃15d。

3. 动物模型的建立：实验前所有动物禁食12h。1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。开腹前，所有大鼠由股静脉缓慢输注林格液（6mg/kg）；进腹后，假手术组仅解剖十二指肠韧带而不阻断肝血流，其余各组采用夹闭肝蒂方式阻断肝血流40min后恢复血流。各组大鼠于再灌注24h后处死，取材检测相关指标。

4. 组织取材和指标检测：下腔静脉取血制备血清，常规肝组织取材、匀浆制备及HE染色。全自动生物化学分析仪（7020型，购自日本日立公司）检测血清中ALT、AST活性。光学显微镜下观察肝组织病理学变化情况。肝组织ROS、SOD、MDA水平及TNFα、IL-1含量的检测按试剂盒说明书操作。

5. 统计学分析：计量资料数据以均数±标准差（x-±s）表示，经方差齐性检验，方差齐者作方差分析，用q检验行两两比较；方差不齐者作秩和检验，总体有差异者进一步做秩转换，然后采用q检验作两两比较。采用SPSS13.0软件进行数据分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

二、结 果

1. 血清ALT、AST水平的变化：与假手术组相比，IR组大鼠血清中ALT、AST水平明显升高（q值分别为39.18，26.40，P值均<0.05）。给予低剂量SI后，与IR组比较，大鼠血清ALT、AST水平降低（q值分别为9.13，6.77，P值均<0.05）；并且随着SI剂量增加，效果越明显，SI2与SI1组比较（q值分别为8.35，5.51，P值均<0.05）、SI3与SI2组比较（q值分别为9.13，5.37，P值均<0.05），差异均有统计学意义。见表1。

表1  各组大鼠血清ALT、AST水平比较（x-±s）

组别       动物数（只）          ALT（U/L）      AST（U/L）

S组 10    128.16±12.44     413.82±24.19

IR组      9    1284.89±93.99a    1049.81±77.40a

SI1组     8    853.69±53.17b   709.33±42.31b

SI2组     8    696.71±52.98bc  629.15±43.03bc

SI3组     9    470.39±29.99bcd       545.65±60.03bcd

  注：S组：假手术组；IR组：缺血再灌注组；SI1、SI2、SI3组：分别为低、中、高剂量大豆异黄酮干预组；a 与S组比较，P<0.05；b 与IR组比较，P<0.05；c 与SI1组比较，P<0.05；d 与SI2组比较，P<0.05

2. 大鼠肝组织形态学变化：光学显微镜下，假手术组肝组织结构规则，细胞形态正常。IR组肝组织有明显的病理学改变：肝小叶结构紊乱，片状肝细胞坏死和水肿，有明显中性粒细胞浸润。三种不同剂量SI组肝脏损伤程度较IR组明显减轻，仅见肝细胞点状坏死、凋亡以及细胞质空泡形成。见图1。

3. 大鼠肝组织SOD活性及ROS、MDA、TNFα、IL-1水平的变化：IR组大鼠肝组织中ROS、MDA、TNFα、IL-1水平均明显高于假手术组（q值分别为9.04，12.86，15.51，27.77，P值均<0.05），SOD活性降低（q＝15.98，P<0.05）。SI预处理后，肝组织中ROS、TNFα、IL-1水平均呈下降趋势，SI1组与IR组比较（q值分别为5.49，8.86，7.82，P值均<0.05）、SI2组与IR组比较（q值分别为5.21，12.18，12.91，P值均<0.05）、SI3组与IR组比较（q值分别为11.56，12.24，16.06，P值均<0.05），差异均有统计学意义。与IR组比较，中、高剂量SI能降低缺血再灌注后大鼠肝匀浆中MDA的水平，差异有统计学意义（q值分别为4.62，6.72，P值均<0.05）；而升高大鼠肝脏匀浆SOD的活性（q值分别为11.84，5.38，P值均<0.05）。见表2。

三、讨论

肝移植、大失血、复杂的肝切除术、严重肝创伤的处理等，均可导致急性肝缺血和随后的再灌注问题，使肝组织结构改变、肝细胞功能丧失，最终导致肝脏损伤及肝功能衰竭[1]。本研究用SI对HIRI大鼠进行预处理，结果表明，低、中、高SI剂量组大鼠血清ALT、AST水平较IR组均明显降低，且呈剂量效应关系；镜下观察显示三种剂量SI组大鼠肝脏病理损伤程度也较IR组明显减轻。提示大鼠肝缺血前的SI预处理对再灌注损伤的肝脏具有保护作用。我们对其保护机制进行了初步探讨。

HIRI发病机制复杂，早期以氧化应激和释放ROS直接导致肝细胞损伤为特征。ROS主要由再灌注后激活的枯否细胞及黏附的中性粒细胞产生，它可直接损伤肝细胞膜，导致肝细胞破坏；还可损伤肝血管内皮细胞引起微循环完整性的丧失和血流减少，促进病情发展。HIRI过程产生大量ROS，同时导致多种抗氧化酶如SOD、过氧化氢酶等活性降低、肝组织中MDA含量增加、脂质过氧化程度加重[4]。本研究结果显示，中、高剂量SI能提高缺血肝脏SOD活性及降低ROS、MDA的含量，表明中、高剂量SI能提高机体抗氧化酶系统的活性，有助于消除ROS，抑制脂质过氧化，减轻ROS对肝脏的损害程度；低剂量SI对肝组织SOD及MDA影响不明显，可能与其浓度较低有关，也可能低剂量SI主要通过提高其他抗氧化酶活性清除ROS。

HIRI晚期主要是中性粒细胞聚集介导的炎症紊乱过程。在此过程中，枯否细胞中核因子-κB首先被激活，进而诱发TNFα、IL-1、细胞黏附分子-1等因子表达增加，在这些因子协同作用下，中性粒细胞在病灶区聚集，造成肝组织损伤[5]。本实验结果显示，三种SI剂量组肝组织中TNFα和IL-1含量均较IR组明显降低，说明SI干预能显著降低TNFα及IL-1在肝组织中的高表达，从而减轻由TNFα、IL-1介导的肝脏进一步损伤。

总之，SI预处理对HIRI具有保护作用，其机制可能与清除ROS、抑制脂质过氧化及抑制炎性细胞因子生成等有关。

参  考  文  献

[1]Montalvo-Jave EE, Escalante-Tattersfield T, Ortega-Salgado JA, et al. Factors in the pathophysiology of the liver ischemia-reperfusion injury. J Surg Res, 2008, 147: 153-159.

[2]Ye HY, Zhang XL, Zhou L, et al. The effect of soybean isoflavone on myocardium against ischemia reperfusion injury in rats. Zhongyao Yaoli Yu Linchuang, 2005, 21: 21-22. (in Chinese)

叶和杨,张小玲,周莉,等.大豆异黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.中药药理与临床,2005,21:21-22.

[3]Xing Y, Tian QW, Wang YM, et al. The protective effects of soybean isoflavones on transient cerebral ischemic mice. Yingyang Xuebao, 2006, 28: 85-86. (in Chinese)

邢岩,田庆伟,王永明,等.大豆异黄酮对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用.营养学报,2006,28:85-86.

[4]Ushitora M, Sakurai F, Yamaguchi T, et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release, 2010, 142: 431-437.

[5]Zhang S, He XS. The molecular mechanism of warm ischemia-reperfusion injury in liver graft. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2003, 11: 767-768. (in Chinese)

张劭,何晓顺.肝脏缺血再灌注损伤分子调控的研究进展.中华肝脏病杂志,2003,11:767-768.

（收稿日期：2009-11-24）

（本文编辑：朱红梅）

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