炎症干扰胆固醇调节元件结合蛋白2致ApoESRACD36三基因敲除小鼠肝脏脂质的异常积聚

【摘要】  目的  研究炎症是否通过干扰核转录因子胆固醇调节元件结合蛋白2（SREBP-2）而致ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠肝脏胆固醇的异常积聚。 方法  将8周龄ApoE/SRA/CD36三基因敲除雄性小鼠随机分为对照组（n＝8）和炎症组（n＝8），2组均喂以西方饮食（Western diet），炎症组小鼠皮下注射10%酪蛋白建立慢性炎症模型，对照组注射相应量磷酸盐缓冲液，14周后处死，测定血清中炎症介质和脂质的水平及肝组织中胆固醇含量，油红O、免疫组织化学染色后观察肝脂质沉积程度以及组织形态变化，实时定量PCR法检测肝脏SREBP裂解激活蛋白（SCAP）、SREBP-2及其下游基因低密度脂蛋白受体（LDLr）mRNA水平。对计量资料采用两样本均数比较的t检验进行统计学分析。 结果  炎症状态下，血清中总胆固醇［（7.72±1.70）mmol/L］、低密度脂蛋白胆固醇［（2.94±0.44）mmol/L］、高密度脂蛋白胆固醇［（2.24±0.63）mmol/L］水平均显著降低，与对照组［分别为（13.23±3.61）mmol/L、（9.28±3.66）mmol/L、（4.13±0.42）mmol/L］比较，t值分别为3.383、4.245、5.937，P值均<0.05；肝组织中胆固醇含量显著增加；油红O染色表明，胆固醇在肝脏中的沉积异常增多（t＝2.707，P<0.05）；实时定量PCR和免疫组织化学检测结果表明胆固醇代谢相关基因SREBP2、LDLr和SCAP的mRNA和蛋白质表达水平显著增加。 结论  炎症可以通过干扰SREBP-2导致低密度脂蛋白胆固醇摄取异常，造成肝脏脂质沉积增多和损害。

【关键词】  炎症； 肝脏； SREBP-2； ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠

Inflammation enhances the accumulation of lipid in ApoE/SRA/CD36 KO mice liver   YAN Feng, HUANG Ai-long, XU Zhen-e, RUAN Xiong-zhong, CHEN Ya-xi. Center for Lipid Research, Key Laboratory of Molecular Biology on Infectious Diseases,  Ministry of Education, Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Corresponding author: CHEN Ya-xi, Email: zlcyxi@ sina.com

Co-corresponding author: RUAN Xiong-zhong, Email: xzruan@ hotmail.co.uk. Center for Nephrology, Royal Free and University College Medical School, University College, London, Royal Free Campus, London, UK

【Abstract】 Objective    To investigate if inflammatory stress enhances liver lipid accumulation via SREBPs mediated dysregulation of low density protein receptor (LDLr) expression in apolipoprotein E, scavenger receptors class A and CD36 triple knockout (ApoE/SRA/CD36 KO) mice. Methods    16 Male ApoE/SRA/CD36 KO mice were subcutaneously injected with 0.5 ml 10% casein or PBS. The mice were fed a Western diet (Harlan, TD88137) containing 21% fat and 0.15% of cholesterol for 14 weeks. Animals were sacrificed and blood samples were collected. The serum amyloid A (SAA), IL-6, total cholesterol (TC), LDL and high density protein (HDL) were assayed. The lipid accumulation in liver was evaluated by Oil Red O staining. The mRNA and protein expression of SREBP-2, SREBPs cleavage activating protein (SCAP) and LDLr were analyzed by Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry staining. Results    Blood levels of SAA [(26.60±3.24) ng/ml vs (14.35±1.73) ng/ml, P < 0.01] and IL-6 [(36.37±2.20) pg/ml vs (18.02±4.87) pg/ml, P < 0.01] were higher, while TC [(7.72±1.70) mmol/L vs (13.23±3.61)mmol/L, P < 0.01], LDL-cholesterol [(2.94±0.44) mmol/L vs (9.28±3.66) mmol/L, P < 0.01] and HDL cholesterol [(2.24±0.63) mmol/L vs (4.13±0.42) mmol/L, P < 0.01] were lower in inflamed mice compared to controls. ORO staining showed that lipid accumulation in the liver was more extensive in inflamed group despite lower blood lipid levels. Meanwhile, Real Time PCR data showed inflammation induced the expression of LDLr (4.56 fold), SCAP (3.14 fold) and SREBP-2 (14.72 fold) in liver. Immunohistochemical staining also indicated increased proteins expression in the liver, which was consistent with mRNA data. Conclusions    Inflammation causes lipid accumulation in liver via disrupting SREBP-2 and LDLr expression.

【Key words】Inflammation; Liver; SREBP-2; ApoE/SRA/CD36 KO mice

目前，脂肪肝已成为慢性肝病的最常见病因之一，脂肪肝的发病机制是极其复杂的，至今尚不完全清楚。近年的研究结果显示，慢性炎症在非酒精性脂肪肝（NAFLD）的发生、发展及预后中起了关键的作用[1]。胆固醇调节元件结合蛋白2（sterol-responsive element-binding protein，SREBP-2），作为一种膜结合的核转录因子，在胆固醇代谢中起中心作用，与其调控的下游基因低密度脂蛋白受体（LDLr）和其上游的胆固醇敏感器SREBP裂解激活蛋白（SCAP）形成SCAP-SREBPs-LDLr这一依赖于胞内胆固醇水平的反馈调节系统。生理状态下，这个系统维持细胞内胆固醇的内稳态平衡，而炎症状态下，该平衡被打破，导致胆固醇在细胞内异常积聚。我们通过广泛的体外实验证实，慢性炎症可以明显改变细胞内胆固醇的内稳态平衡而加重组织的细胞脂质沉积[2-4]。本研究中，我们采用ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠进行体内试验，进一步探讨慢性炎症是否可以通过干扰SREBP-2导致胆固醇经LDLr途径摄入异常，加重胆固醇在肝脏组织的沉积和损害。

材料与方法

一、实验材料

模型小鼠制备：16只雄性 ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠，清洁级，体质量18～23g(由美国Lerner研究所Maria Febbraio教授惠赠)，均喂以西方饮食（Western diet：TD88137，21%黄油，0.15%胆固醇）；16只小鼠被随机分为两组，对照组8只，皮下注射磷酸盐缓冲液（PBS）；炎症组8只，皮下注射10%酪蛋白，隔日注射0.5ml。14周后处死小鼠，收集血清和肝脏组织标本。

二、方法

1. 标本采集：对小鼠禁食过夜，腹腔注射2%戊巴比妥钠0.1ml进行麻醉后迅速解剖，经左心室取血分离血清，取出肝脏置于冰PBS中充分洗涤后，分三部分：一部分固定于多聚甲醛溶液中，进行脱水、透明、浸蜡、包埋、制片，免疫组织化学染色；一部分包埋于OCT胶中制作冰冻切片，油红O染色观察肝细胞脂肪变性的程度；另一部分肝组织冻存于-80℃，用于组织胆固醇含量、LDLr、SREBP-2、SCAP的mRNA的测定。

2. 血脂检测：按照试剂盒中说明书测定血清中的小鼠血清淀粉酶A（SAA）、白细胞介素（IL）-6、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）水平。试剂盒购自重庆百杰生物公司。

3. 肝组织胆固醇含量检测：肝脏组织研磨后加PBS溶解，离心，沉淀物中加入1ml氯仿、甲醇混合物（2∶1），超声破碎1min。之后将样品放入摇摆孵箱震荡15min，再离心。上清液经真空干燥后，用酶法[4]测定TC和游离胆固醇（FC）的含量；沉淀加入NaOH后，孵育12h，用Lowry法测定总蛋白量。胆固醇酯（CE）=TC-FC，得出的结果除以总蛋白量即为胆固醇酯的含量。

4. 油红O染色检测肝组织脂质：将肝脏组织制成厚6～10μm冰冻切片，于空气中干燥5min，用4%甲醛溶液固定30min。1，2－丙二醇孵育2min，用油红O脂肪染色工作液染色15min，自来水冲洗5min，干燥后用GVA水溶性封片剂包埋。显微镜明视野下400倍放大观察并照相（德国Leika公司DM系列正置显微镜）。

5. 免疫组织化学检测：按照说明书采用二步法进行染色，第一抗体浓度分别为1∶500（LDLr）、1∶300（SREBP-2）、1∶300（SCAP）。试剂盒购自北京中杉生物公司。

6. 实时定量PCR(real time PCR)法检测mRNA：提取肝脏总RNA（试剂盒购自美国Promega公司），用微量分光光度计（购自美国Bio-Rad公司）检测RNA样品纯度（A260/A280值范围为1.7～2.0）。用逆转录试剂盒（购自美国Applied Biosystems公司）转录得cDNA，10μl逆转录体系中包括2μl 10×RT缓冲液，0.8μl 25×dNTP mix，2μl 10×RT 随机引物，1μl multiscribeTM 逆转录酶，3.2μl去核酸水（含1μg总RNA），逆转录条件如下：25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5s，保存于-20℃。以cDNA为模板，以18s为内参照，应用Power SYBR Green PCR Master Mix （购自美国Applied Biosystems公司）进行实时定量PCR（iQ5 RT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司），LDLr、SREBP-2、SCAP引物序列见表略。循环参数如下：50℃ 2min，95℃ 5min；95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，共40个循环。实时定量PCR结果采用Ct值比较相对定量法（relative quantitation with comparative Ct method，ΔΔCt in separate tubes）定量，18s作为参照管。用ΔΔCt来计算基因的表达水平，计算公式如下：炎症相对于对照组基因表达水平的倍数＝-exp(ΔΔCt)，其中ΔΔCt＝炎症组ΔCt -对照组ΔCt；ΔCt＝具体测定的基因Ct值-18s基因Ct值。

7. 统计学处理：用SPSS11.5统计分析软件处理实验数据，所得计量资料的数据以均数±标准差表示（x-±s），采用两样本均数的t检验进行比较分析。

结    果

1. 小鼠血清炎症介质和脂质水平测定：与对照组小鼠相比，炎症组小鼠SAA和IL-6水平均明显增高（t值分别为6.927和6.769，P值均<0.01），见表略。同时，炎症组小鼠血清中TC、HDL、LDL水平与对照组相比，均明显下降（t值分别为3.383，5.937和4.245, P值均<0.01)，见表略。

2. 实时定量PCR检测mRNA表达：与对照组小鼠相比，炎症组小鼠肝脏细胞SREBP-2、SCAP、LDLr mRNA表达水平均明显上调，分别上调了（14.72±4.17）倍、（3.14±1.49）倍、（4.56±2.11）倍，差异有统计学意义（P<0.05）。

3. 小鼠肝脏组织冰冻切片油红O染色：对照组小鼠肝细胞中有少量红染颗粒，脂质沉积不明显，结构正常，肝细胞排列整齐；而炎症组小鼠呈现肝细胞脂肪变性，肝细胞体积增大，胞质中有大量的红染颗粒，胞核被推向周边，脂质沉积异常增加，排列紊乱，见图略。

4. 小鼠肝脏组织胆固醇含量测定：炎症组小鼠肝细胞内胆固醇酯的含量显著高于对照组（t＝2.707，P<0.05），见图略。

5. 小鼠肝脏SREBP-2、SCAP、LDLr蛋白免疫组织化学检测：对照组小鼠肝细胞中的SREBP-2、SCAP、LDLr蛋白表达基本正常，而炎症组小鼠肝细胞中的上述几种蛋白表达均明显增加，见图略，与mRNA检测结果相符。

讨    论

脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内中性脂肪（主要是甘油三酯与胆固醇酯）堆积过多的代谢性疾病。目前的研究结果表明，炎症反应参与了NAFLD的发生和发展全过程。用基因敲除的方法阻断肝脏或脂肪组织中炎症反应的通路，可以显著降低脂肪在肝脏聚集[5]。这些研究结果说明系统和肝脏局部的炎症反应在NAFLD形成中起关键作用，而炎症反应是如何修饰脂肪代谢，从而导致脂肪在肝脏聚集的分子机制并不清楚。

SREBP属于核转录因子超家族，可激活一系列涉及内源性胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂等生物合成及脂质摄取所需要的酶[6]。SREBP包括三个成员：SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2。其中，SREBP-2主要调节胆固醇代谢[7]，与LDLr基因启动子上的胆固醇调节元件发生特异性结合，从而增强LDLr的转录[8]。SREBP-2的转录又受其上游的SCAP调控，于是形成了SCAP-SREBPs-LDLr这样一个胆固醇反馈调节系统[9]，这个严密的反馈调节系统维持着细胞内胆固醇的内环境稳定。传统的理论认为，未修饰的低密度脂蛋白（LDL，胆固醇的主要载体）通过LDLr途径被摄入细胞（受SCAP-SREBPs-LDLr反馈系统调节），正常情况下，细胞不会产生脂质沉积；病理状态下，氧化或乙酰化修饰了的脂蛋白通过清道夫受体（主要是SRA和CD36[10]）无控制地被摄入细胞；ApoE存在于细胞表面，与LDLr和其他LDLr家族成员有很高的亲和力，介导脂质从外周摄入肝脏[11]。因此，本研究选用了ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠作为实验模型，排除了脂质经清道夫受体途径摄入细胞内的干扰，试图证明炎症通过干扰肝细胞SREBP-2致肝脏脂质异常积聚可能的分子机制。

动物实验结果显示，炎症组小鼠SAA、IL-6水平明显高于对照组，小鼠体内存在低丰度、系统性炎症，三基因敲除小鼠炎症模型建立成功。我们通过进一步检测发现：炎症组小鼠肝脏的SREBP-2基因和蛋白水平的表达均高于对照组，说明炎症上调了SREBP-2基因的转录和蛋白质的表达。同时油红O染色显示炎症组小鼠呈现肝细胞脂肪变性，肝脏细胞中有大量的红染脂质颗粒，肝脏的异常脂质沉积增加，并且肝脏结构有轻微改变，提示SREBP-2的上调与肝脏脂质沉积增多有密切联系。

我们在体外肝细胞模型研究中已经证实，炎症状态下，胆固醇严密的反馈调节机制被破坏，细胞可以通过LDLr途径摄入大量未修饰的LDL，造成脂质沉积[2]。我们在三基因敲除小鼠炎症模型上同样观察到：炎症组肝脏LDLr基因和蛋白表达均明显高于对照组，说明SREBP-2的增加上调了下游靶基因的表达，胆固醇通过LDLr途径的摄入作用增强。血浆脂质检测结果显示，炎症组TC水平明显比对照组降低，而肝脏组织中胆固醇酯的含量明显增高，进一步说明由于LDLr异常摄取胆固醇造成肝细胞内脂质异常增多而血清中胆固醇水平降低。这一结果也与Ma等[3]应用ApoE KO小鼠的实验结果一致，炎症介质可以促进LDLr表达增高，导致未被修饰的LDL胆固醇在细胞内异常积聚。

我们通过建立ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠慢性炎症模型，证实了慢性炎症状态下，炎症介质可以上调核转录因子SREBP-2的表达，导致其下游靶基因LDLr表达异常增加，进一步通过LDLr途径致肝脏细胞从血液中摄取过多的胆固醇, 引起肝脏出现大量异常的脂质沉积。炎症可能是脂肪性肝病发病机制中的独立危险因子，也为临床治疗、新药开发提供了新线索和新思路。

参  考  文  献

[1]Haukeland JW, Dam錽 JK, Konopski Z, et al. Systemic inflammation in nonalcoholic fatty liver disease is characterized by elevated levels of CCL2. J Hepatol, 2006, 44: 1167-1174.

[2]Chen Y, Ruan XZ, Li Q, et al. Inflammatory cytokines disrupt LDL-receptor feedback regulation and cause statin resistance: a comparative study in human hepatic cells and mesangial cells. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 293: F680-687.

[3]Ma KL, Ruan XZ, Powis SH, et al. Inflammatory stress exacerbates lipid accumulation in hepatic cells and fatty livers of apolipoprotein E knockout mice. Hepatology, 2008, 48: 770-781.

[4]Ye Q, Chen Y, Lei H, et al. Inflammatory stress increases unmodified LDL uptake via LDL receptor: an alternative pathway for macrophage foam-cell formation. Inflamm Res, 2009, 58: 809-818.

[5]Mas E, Danjoux M, Garcia V, et al. IL-6 deficiency attenuates murine diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. PLoS One, 2009, 4: e7929. 

[6]Brown MS, Goldstein JL. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell, 1997, 89: 331-340.

[7]Eberl D, Hegarty B, Bossard P, et al. SREBP transcription factors: master regulators of lipid homeostasis. Biochimie, 2004, 86: 839-848.

[8]Rawson RB. The SREBP pathway--insights from Insigs and insects. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4: 631-640.

[9]Nohturfft A, Yabe D, Goldstein JL, et al. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell, 2000, 102: 315-323.

[10]Kunjathoor VV, Febbraio M, Podrez EA, et al. Scavenger receptors class A-I/II and CD36 are the principal receptors responsible for the uptake of modified low density lipoprotein leading to lipid loading in macrophages. J Biol Chem, 2002, 277: 49982-49988.

[11]Kockx M, Jessup W, Kritharides L. Regulation of endogenous apolipoprotein E secretion by macrophages. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008, 28: 1060-1067.

（收稿日期：2010-01-07）

（本文编辑：金生）

中华医学会肝脏病杂志版权