肿瘤坏死因子α对急性肝坏死小鼠肠道分泌型IgA变化的影响

【关键词】肿瘤坏死因子α； 免疫球蛋白A，分泌； 急性肝坏死

Effect of TNF alpha on gut secretory IgA in mice with acute liver necrosis    LIU Dong-yan, DING Peng, LIU Pei.

【Key words】Tumor necrosis factor alpha; Immunoglobulin A, secretory; Liver necrosis, acute

【First author’s address】Research Center, Shengjing Hospital, Affiliated  to Chinese Medical University, Shenyang 110004, China

Email: dongyan.liu@yahoo.com.cn

据报道，重型肝炎患者血清中肿瘤坏死因子（TNF）α明显升高[1-2]，因此，有学者认为TNFα在急性肝坏死时对肝损伤起重要作用，是导致肝坏死的重要介质之一[3]。我们用脂多糖（LPS）/D-氨基半乳糖（GalN）建立急性肝坏死模型，并用抗小鼠TNFα-IgG抗体和抗小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFα-R1）抗体进行阻断，同时用TNFα代替LPS建立急性肝坏死动物模型，以观察TNFα是否是影响分泌型IgA（SIgA）变化的一个因子，从而探讨TNFα是否在急性肝坏死时对肠道SIgA的变化起作用，并验证SIgA变化是否可导致腹膜炎。

一、材料与方法

1. 试剂：GalN购自北京药物研究所，LPS(E.coli O127: B8)、小鼠rmTNFα、抗小鼠IgA抗体购自美国Sigma公司，抗小鼠TNFα-IgG抗体购自美国Biology公司，抗小鼠TNFα-R1抗体购自美国R&D公司，抗小鼠分泌片（SC）抗体购自美国Bethyl公司，免疫组织化学SP试剂盒购自北京中山公司。T7体外转录试剂盒、Real time quantitative PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。

2. 动物分组及动物模型建立：雄性Balb/C小鼠230只，6～8周龄，体质量18～22g，购自中国医科大学动物中心。随机分为5组：等渗盐水对照组（10只）、抗TNF-IgG组（10只）、抗TNF-R1组（10只）、TNFα/GalN肝坏死组（100只）、LPS/GalN肝坏死组（100只）。第4、5组分2、6、9、12、24h共5个时间点观察，每个时间点10只小鼠；其他各组以9h为观察点。GalN 800mg/kg，LPS 10μg/kg，TNFα 10μg/kg，均为腹腔注射，对照组为相同体积等渗盐水腹腔注射；抗TNF-IgG组于注射LPS/GalN前30min尾静脉注射（100μg/只），抗TNF-R1组于注射LPS/GalN前15min尾静脉注射（100μg/只）。颈椎脱臼处死小鼠，刨开腹腔取出肝肠组织，迅速放入40%甲醛溶液中，待做肝肠组织的HE染色和免疫组织化学检查。

3. 肠道IgA、SC免疫组织化学染色：将石蜡包埋的小鼠肠组织切成6μm厚切片，常规用二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水；依次加入H2O2、兔血清、抗IgA抗体和SC抗体、生物素标记的IgG抗体、酶标记的卵白素、DAB显色。

4. 实时定量PCR检测小鼠肠组织SC的相对含量：从小鼠肠组织中提取总RNA，取每个样本RNA 100ng转录为cDNA，引物序列：SC正义链为5′-CAGACATTAGCA TGGCAGACTTCAA-3′，反义链为5′-TGCCGAGTA GGCCATGTCAG-3′；3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）正义链为5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′, 反义链为5′-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3′。PCR反应条件：95℃ 10s；95℃ 5s，60℃ 20s，共循环45次；60℃ 1min，95℃ 5s。通过管家基因校正，检测各组肠组织中SC目的基因的相对表达量。SC mRNA的相对表达量=SC基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数，校正结果以等渗盐水组为1，其余组与之比较。

5. 统计学分析：数据以均数±标准差（x-±s）表示，采用SPSS10.0软件进行t检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. 小鼠一般情况：TNFα/GalN肝坏死组与LPS/GalN肝坏死组小鼠注射以后，出现懒动、摄水与觅食减少现象，皮毛松散，甚至抽搐；于注射后6h开始死亡，9h达高峰，死亡率均超过56%。说明由TNFα/GalN与LPS/GalN可以诱导出相同症状的动物模型。

2. 小鼠肝组织：HE染色，光学显微镜下见等渗盐水组肝脏呈现清楚的肝小叶结构，肝小叶以中央静脉为中心，肝索呈放射状排列，肝细胞完整，肝血窦清晰（图略）。由LPS/GalN或TNFα/GalN引起的急性肝坏死随时间延长逐渐加重，2h时肝脏有少量点状坏死；6h时肝脏出现多处点状坏死，肝细胞肿胀，有较多肝细胞变性和细胞核溶解（图略）；9h、12h时肉眼可见肝脏体积明显变大，颜色呈酱紫色，镜下可见成片的出血性坏死，残存的肝细胞肿胀，坏死区可见大量炎性细胞（图略）；24h时有多处点状坏死，肝细胞肿胀，多处出血，灶状坏死处有淋巴细胞浸润。

3. 小鼠肠组织：HE染色，光学显微镜下见对照组肠绒毛完整，无上皮脱落及碎屑形成；坏死组部分绒毛不完整，细胞水肿及炎性细胞浸润（图略）。

4.肠道IgA免疫组织化学结果：等渗盐水对照组、抗TNF-IgG组、抗TNF-R1组肠组织肠上皮细胞质、胞膜和固有层活化淋巴细胞呈棕黄色强阳性（图略）；急性肝坏死组肠上皮细胞质阳性明显减弱（图略）。

5. 肠道SC免疫组织化学结果：等渗盐水对照组、抗TNF-IgG组、抗TNF-R1组肠上皮细胞膜呈棕黄色强阳性（图略）；急性肝坏死组肠组织肠上皮细胞膜阳性明显减弱（图略）。

6. 由TNF/GalN诱导的肝坏死小鼠肠组织SC mRNA的表达：等渗盐水对照组小鼠SC mRNA相对表达量为5.62±1.93，LPS/GalN组与TNFα/GalN组2、6、9h SC mRNA的表达量均下降，LPS/GalN组相对表达量分别为2.88±1.85、2.32±0.05、0.46±0.49，与等渗盐水对照组比较，差异有统计学意义 (t值分别为7.35，7.66，8.19，P值均<0.01)。抗体组SC mRNA表达量与对照组相比，无明显变化。见图5。

三、讨论

肝坏死是一类肝细胞广泛坏死的晚期病症，常引起胃肠道分泌、吸收、运动、屏障、循环等方面的功能障碍。严重肝病时，近端小肠内细菌大量增殖，破坏了肠黏膜屏障，产生大量内毒素及其他毒性产物，并经受损的黏膜吸收入血。SIgA是肠黏膜屏障的重要组成成分，对黏膜固有的和入侵的病原体具有防御作用。SIgA不能诱发炎症反应，主要发挥免疫排除作用，在肠道起免疫平衡作用[4-5]；还可减少细菌易位，限制细菌穿透肠上皮[6]。SC、二聚体IgA和J链通过共价键形成SIgA，SC由肠上皮细胞分泌产生，是黏膜免疫系统的一种重要转膜糖蛋白，对肠黏膜有保护作用[7]。

本研究中，预先注射抗小鼠TNFα-IgG抗体和抗小鼠TNFα-R1抗体阻断LPS/GalN诱导的急性肝坏死，证明TNFα在急性肝坏死过程中发挥重要作用；同时我们用TNF代替LPS诱导急性肝坏死，小鼠出现的症状和死亡率与LPS/GalN组相同，肝肠病理变化相似，进一步证明TNFα在急性肝坏死过程中发挥重要作用。对肠组织进行IgA、SC的免疫组织化学检测结果显示，LPS/GalN、TNFα/GalN组肠上皮细胞质阳性程度较对照组、抗体阻断组、受体阻断组明显减弱。用real-time PCR方法检测肠道SC mRNA表达情况，结果也显示肝坏死组小鼠SC mRNA的表达水平较对照组、抗体阻断组、受体阻断组显著下降。其原因可能是：首先，急性肝坏死同时伴有血清及腹水中TNFα异常增高，可破坏肠黏膜上皮细胞以损伤肠道微循环，破坏肠道免疫细胞生存环境或直接损伤细胞，使肠道屏障储备耗竭，免疫细胞分泌功能减退，IgA和SC合成及分泌减少。其次，在急性肝坏死时常伴有营养不良，肠道营养不良时肠道SC明显减少[8]。SC、IgA是组成SIgA的重要组成成分，SC、IgA的减少导致SIgA的减少，SIgA是肠道第一线防御，因此，SC、IgA减少可能是急性肝坏死伴发腹膜炎的一个原因。

参  考  文  献

[1]Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al. Effect of plasma exchange on serum tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and cytokine concentrations in patients with fulminant hepatitis. Blood Purif, 2000,18: 50-54.

[2]Corredor J, Yan F, Shen CC, et al. Tumor necrosis factor regulates intestinal epithelial cell migration by receptor-dependent mechanisms. Am J Physiol Cell Physiol, 2003, 284: C953-961.

[3]Leist M, Gantner F, Jilg S, et al. Activation of the 55 kDa TNF receptor is necessary and sufficient for TNF-induced liver failure, hepatocyte apoptosis, and nitrite release. J Immunol, 1995, 154: 1307-1316.

[4]Boullier S, Tanguy M, Kadaoui KA, et al. Secretory IgA-mediated neutralization of Shigella flexneri prevents intestinal tissue destruction by down-regulating inflammatory circuits. J Immunol, 2009, 183: 5879-5885.

[5]Corth雜y B. Secretory immunoglobulin A: well beyond immune exclusion at mucosal surfaces. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2009, 31: 174-179.

[6]Macpherson AJ, Slack E. The functional interactions of commensal bacteria with intestinal secretory IgA. Curr Opin Gastroenterol, 2007,23:673-678.

[7]Murthy AK, Dubose CN, Banas JA, et al. Contribution of polymeric immunoglobulin receptor to regulation of intestinal inflammation in dextran sulfate sodium-induced colitis. J Gastroenterol Hepatol, 2006, 21: 1372-1380.

[8]Ha CL, Woodward B. Depression in the quantity of intestinal secretory IgA and in the expression of the polymeric immunoglobulin receptor in caloric deficiency of the weanling mouse. Lab Invest,1998, 78: 1255-1266.

（收稿日期：2010-01-04）

（本文编辑：朱红梅）

中华医学会肝脏病杂志版权