瘦素特异性小干扰RNA对实验性肝纤维化的影响

【摘要】  目的  研究针对大鼠瘦素基因的小干扰（si）RNA对肝纤维化的治疗效果。 方法  将40只雄性SD大鼠平均分为4组，正常对照组皮下注射橄榄油溶液3ml/kg，2次/周，共6周；肝纤维化模型组皮下注射60% CCl4 3ml/kg，2次/周，共6周；siRNA治疗组和阴性对照组均于皮下注射60% CCl4 3ml/kg，2周后尾静脉分别注射siRNA或阴性对照质粒0.2mg/kg。每周测体质量1次，根据体质量调整药物用量。设计针对瘦素mRNA的siRNA，并构建其表达载体；用脂质体方法通过尾静脉注射转染入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内，然后分别采用逆转录-聚合酶链反应、免疫组织化学方法检测瘦素与Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝脏组织中的表达。免疫组织化学资料采用等级资料秩和检验。PCR结果采用单因素方差分析进行统计学处理，P<0.05时用SNK法进行多重比较。 结果  瘦素mRNA在正常对照组组、肝纤维化模型组、siRNA治疗组和阴性对照组的相对表达量分别为0.75±0.03、2.34±0.14、0.90±0.06、2.31±0.13，各组比较，F＝797.64，P＝0.000，差异有统计学意义；I型胶原mRNA在各组的相对表达量分别为1.10±0.11、2.75±0.13、1.27±0.08、2.77±0.12，各组比较，F＝695.71，P＝0.000，差异有统计学意义；Ⅲ型胶原mRNA在各组的相对表达量分别为0.62±0.07、1.52±0.09、0.85±0.08、1.51±0.07，各组比较，F＝371.57，P＝0.000，差异有统计学意义。 结论  针对瘦素基因的siRNA对肝纤维化有明显的治疗作用。

【关键词】  肝硬化； 瘦素； 大鼠； 模型，动物

Effects of decreased leptin expression on liver fibrosis    FENG Hai-juan, ZHU Jing, PAN Liang, LU Jing-xian, XIAO Ming-bing, HUANG Hua, NI Run-zhou, LU Cui-hua. Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong Jiangsu Province 226000, China

Corresponding author: LU Cui-hua, Email: lch670608@ sina.com.cn

【Abstract】 Objective    To study the effects of decreased leptin expression on liver fibrosis. Methods    The small interfering RNA, targeting leptin gene, was designed according to the secondary structure of leptin gene. The recombinant plasmids were encapsulated with lipofectamin and then injected into carbon tetrachloride (CCl4) induced rat liver fibrosis models. Leptin and I, III collage were detected by immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR). Results    The mRNA and protein levels of leptin in the fibrotic liver transfected with leptin shRNA were significantly decreased compared with those in controls (P < 0.01).The depositions of type I and type III collagens were also decreased (P < 0.01). Conclusion    Decreased leptin expression prevents liver fibrosis.

【Key words】Liver corrhosis; Leptin; Rats; Models, animal

本研究中，我们应用CCl4皮下注射法制备大鼠肝纤维化模型，用瘦素mRNA特异性小干扰（si）RNA对肝纤维化大鼠进行治疗，然后分别用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学方法联合检测瘦素与Ⅰ、Ⅲ型胶原在siRNA治疗前后的表达，旨在进一步阐明通过调控瘦素基因对肝纤维化的治疗作用，并为肝纤维化治疗提供新的治疗手段和治疗靶点。

材料与方法

1．动物模型的制备与分组：雄性SD大鼠40只，体质量（150±10）g,由南通大学动物实验中心提供，给予普通饲料与清水。实验动物随机分为4组：肝纤维化模型组10只，给予60%精致橄榄油配制的CCl4 3ml/kg腹壁皮下注射，2次/周，共6周；siRNA治疗组10只，在模型制备2周后同时给予siRNA质粒0.2mg/kg，2次/周，共6周，siRNA质粒给予前与脂质体偶联后通过尾静脉注射导入体内；阴性对照组10只，在模型制备2周后，同时给予阴性对照质粒0.2mg/kg，2次/周，共6周，给予方法同上；正常对照组10只，用精制橄榄油溶液代替CCl4 3ml/kg皮下注射，2次/周，共6周。动物均饲养6周，于最后1次注射3d后处死，取出肝脏，一部分经预冷等渗盐水灌注冲洗残血后采用液氮快速冷冻并置-80℃冰箱中保存待测；另一部分于4%甲醛固定，用于免疫组织化学染色及组织病理学观察。

2. 靶向瘦素基因的siRNA表达载体的构建：根据RNA干扰软件分析，设计寡核苷酸片段，靶序列如下：siRNA：正义链5′-CACCGCTGTGCCTAT CCACAAAGTCTTCAAGAGAGACTTTGTGGA TAGGCACAGCTTTTTTG-3′；反义链5′-GAT CCAAAAAAGCTGTGCCTATCCACAAAGTCTC TCTTGAAGACTTTGTGGATAGGCACAGC-3′。

阴性对照质粒：正义链5′-CACCGTATGAC AACAGCCTCAAGTTCAAGAGACTTGAGG CTGTTGTCATACTTTTTTG-3′；反义链5′-GA TCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAA TCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3′。

单链寡核苷酸片段由上海吉玛生物工程技术服务有限公司设计并合成。经过退火、连接、转化、筛选、限制性内切酶鉴定后，测序证实这些阳性克隆是正确的，即siRNA。

3．RT-PCR检测瘦素与Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达：总RNA提取试剂（购自上海捷瑞生物工程公司）法提取肝组织总RNA，每样本取RNA 5μg为逆转录模板。瘦素与Ⅰ、Ⅲ型胶原的引物各1对，由上海生工生物工程公司合成，其序列及片段大小分别为：瘦素上游引物：5′- TTCACACACGCAGTCGGT AT-3′，下游引物：5′-CTCAGCATTCAGGGCTA AGG-3′，片段大小为371bp；Ⅰ型胶原上游引物：5′-GGCAAG ACAGTCATCGAATACA-3′，下游引物：5′-GATTGGGATGGAGGGAGTTTA-3′，片段大小为147bp；Ⅲ型胶原上游引物：5′-CCA CCCTGAACTCAAGAGC-3′，下游引物：5′-TGAACTGAAAGCCACCATT-3′，片段大小为212bp；内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶上游引物: 5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3′，下游引物：5′-TCCACGACATACTCAGCAC-3′，片段大小为191bp。

按两步法RT-PCR试剂盒（购自美国GENMED公司）操作说明逆转录cDNA，用PCR仪（TC-412，购自英国TECHNE公司）并进行PCR扩增，反应条件：95℃ 2min; 95℃ 30s, 55℃ 1min,70℃ 30s，共35个循环；70℃ 5min。PCR产物经20g/L琼脂糖（购自上海捷瑞生物工程公司）凝胶电泳，采用凝胶定量分析软件（购自江苏捷达科技公司）进行灰度扫描，经与内参照比较分析后计算瘦素和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平。

4．免疫组织化学检测瘦素与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达：第一抗体兔抗大鼠瘦素与Ⅰ、Ⅲ型胶原及第二抗体和免疫组织化学试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，所需组织经由4%甲醛固定，脱水，石蜡切片，脱蜡至水，自动免疫组织化学染色仪（购自美国Labvision公司）染色，苏木素复染，0.1%氯化氢分化，自来水冲洗，在温水中返蓝，切片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜观察以出现明显棕黄色或褐色为阳性。在高倍镜（BX51显微镜，购自日本奥林巴斯公司）下, 每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数至少200个细胞，结果判定标准：阴性（-）：阳性细胞数＜5%；弱阳性（+）：阳性细胞数5%～25%；中等阳性（++）：阳性细胞数25%～50%；强阳性（+++）：阳性细胞数＞50%。同时设磷酸缓冲液为阴性对照。

5．统计学处理：所有数据由SPSS13.0统计软件进行分析。免疫组织化学资料采用Kruskal-Wallis秩和检验法，两两比较采用两两比较的秩和检验（t检验法）。PCR结果采用单因素方差分析进行统计学处理，P<0.05时用SNK法进行多组间的两两比较。

结    果

1．动物情况：肝纤维化模型组死亡1只，其余组动物无死亡。

2．光镜下HE染色形态学变化：正常对照组、siRNA治疗组SD大鼠肝脏小叶结构完整，肝小叶中央静脉周围有放射状排列的肝细胞索，肝窦明显，肝细胞体积正常，多呈单核，汇管区清晰可辨，无明显炎细胞浸润。肝纤维化模型组和阴性对照组大鼠肝小叶结构紊乱，胶原纤维增生明显，有大量纤维间隔形成，并有大量假小叶形成，可见许多脂肪变性。

3．免疫组织化学观察瘦素及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达：正常对照组肝脏组织瘦素无表达，肝纤维化模型组和阴性对照组瘦素表达明显增强，呈棕褐色，分布部位主要位于内皮细胞、窦周细胞及纤维增生区域，siRNA治疗后肝脏组织瘦素仅微量表达，瘦素分布情况各组比较，χ2＝10.8，P＝0.013，差异有统计学意义；Ⅰ、Ⅲ型胶原在正常对照组肝脏只有很少量见于汇管区和中央静脉管壁，Ⅲ型胶原还可见于大血管周围，siRNA治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达跟正常对照组接近，见于汇管区和中央静静脉管壁；肝纤维化模型组和阴性对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原广泛存在于纤维组织增生的汇管区，呈棕褐色。Ⅰ、Ⅲ型胶原分布情况各组比较，χ2值分别为8.9、11.4，P值分别为0.012、0.010，差异均有统计学意义，见表1。

表1  各组大鼠肝组织瘦素和Ⅰ、Ⅲ型胶原的阳性表达结果

组别       动物数    指标                      阳性程度（只）

       （只）           -      +     ++   +++

正常对照组    10    瘦素       10    0     0     0

              Ⅰ型胶原       9    1     0     0

              Ⅲ型胶原       10    0     0     0

肝纤维化模型组    9    瘦素       0    0     0     9

              Ⅰ型胶原       0    0     0     9

              Ⅲ型胶原       0    0     2     7

siRNA治疗组 10    瘦素       8    2     0     0

              Ⅰ型胶原       8    2     0     0

              Ⅲ型胶原       7    3     0     0

阴性对照组    10    瘦素       0    0     1     9

              Ⅰ型胶原       0    0     0     10

              Ⅲ型胶原       0    0     1     9

4．瘦素及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达结果： siRNA治疗后瘦素及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达明显减少，与较肝纤维化模型组比较，q值分别为3.679，3.681和3.679，P值均<0.01，差异均有统计学意义。siRNA治疗后，瘦素mRNA表达未达正常，与正常对照组表达比较，q＝3.790，P＝0.0002，差异有统计学意义。瘦素及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达在肝纤维化模型组与阴性对照组比较，q值分别为0.027，0.018和0.012，P值均＞0.05，差异均无统计学意义，见图1～3，表2。

讨    论

肝纤维化是各种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理学改变，其特征是以胶原为主的细胞外基质各种成分的过度产生和沉积的一种损伤修复过程[1-2]。瘦素是由肥胖基因编码的一种由167个氨基酸组成的分泌型蛋白质[3]，主要由脂肪细胞分泌。Honda等[4]对先天瘦素缺乏大鼠注射肝毒性药物硫代乙酰胺后发现其肝脏组织中没有Ⅰ型前胶原的表达，但经注射重组大鼠瘦素后，在肝小叶中出现了纤维染色，Ⅰ型前胶原mRNA增加。说明瘦素能加速肝纤维化的进程。薛秀兰等[5]在细胞水平研究了靶向瘦素基因的小干扰RNA对肝星状细胞生物学特性的影响，结果显示瘦素特异性siRNA能明显抑制肝星状细胞的活化、增殖，并能诱导肝星状细胞凋亡。

RNA干扰是一项新兴的基因沉默技术，能在转录后水平阻断基因的表达，达到同源基因的减效表达或不表达[6-8]。本研究中，我们成功构建了针对瘦素基因的siRNA真核细胞表达载体,并将其与脂质体偶联后通过尾静脉注射转染人肝纤维化模型大鼠体内，分别通过免疫组织化学和RT-PCR方法证实转染瘦素mRNA siRNA组动物肝组织中瘦素mRNA和蛋白质的表达均较对照组明显下降，说明本研究针对瘦素基因设计的siRNA在大鼠体内确有表达，并能在mRNA水平上阻断实验性大鼠肝脏中瘦素靶基因，从而阻断其翻译成蛋白质。

转染瘦素siRNA组大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显低于阴性对照组与肝纤维化模型组，表明瘦素mRNA siRNA可显著抑制细胞外基质沉积，对肝纤维化有显著改善作用。但另一方面，转染瘦素mRNA siRNA组肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA含量仍高于正常对照组，说明瘦素siRNA治疗在一定时间内未能使纤维化肝脏完全恢复正常；一方面可能是因为我们的疗程或观察时间不足，另一方面也可能是因为其他因素在肝纤维化的发生和发展中的作用，这有待于进一步的研究。

本研究结果表明瘦素在肝纤维化过程中起重要作用，瘦素特异性siRNA在动物体内能有效干扰瘦素mRNA表达，阻断蛋白质的合成，并使Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成减少，从而使细胞外基质减少，治疗肝纤维化。所以瘦素可以作为肝纤维化基因治疗的一个较好的靶位点，瘦素特异性siRNA可作为抗肝纤维化的重要对策，从而为纤维化的治疗提供新的手段和方法。但是，在实际应用中，siRNA长度、结构、组成及其触发的RNA干扰的效果，因基因、种属、序列、细胞类型、甚至实验体系的不同而有变异；siRNA触发人类细胞RNA干扰的研究更为复杂和困难，因此还需要更多的探索。

参  考  文  献

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[5]Xue XL, Lin JS, Song YH, et al. Effect of siRNA targeting leptin gene on biological behaviors of rat hepatic stellate cells.Huazhong Kejidaxue Xuebao (Yixueban), 2006, 35: 331-335. (in Chinese)

薛秀兰,林菊生,宋宇虎,等.靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响.华中科技大学学报（医学版）,2006,35:331-335.

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（收稿日期：2009-10-10）

（本文编辑：孙宇航）

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