普伐他汀对HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响

【摘要】目的  观察普伐他汀对肝癌细胞株HepG2细胞增殖及侵袭、运动能力的影响。 方法  将培养的HepG2细胞随机分为对照组和高、中、低浓度普伐他汀组（普伐他汀分别为0.01、0.10、1.00g/L），四甲基偶氮唑盐比色法测定普伐他汀对HepG2细胞增殖的影响；Matrigel侵袭实验和迁移实验检测普伐他汀对HepG2细胞的侵袭和运动能力的影响；p38活性试剂盒测定p38活性；Western blot测定磷酸化p38（p-p38）、丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MKP-1）、Ras相似物C（ras homologue C，RhoC）及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达。数据分析采用方差分析，各浓度组与对照组之间采用Dunnett-t法进行比较。 结果  不同浓度普伐他汀处理细胞后，低、中、高浓度普伐他汀组HepG2细胞增殖率分别为89.51%±9.55%、75.53%±8.33%、64.99%±7.87%，p38活性分别为87.45%±8.22%、73.18%±8.32%、60.11%±7.21%，p-p38表达量分别为83.18%±10.71%、49.83%±6.36%、30.70%±4.66%，MKP-1表达量分别为127.89%±15.38%、153.96%±18.99%、182.63%±20.21%，RhoC表达量分别为81.08%±9.66%、57.11%±7.89%、33.65%±4.78%，MMP-2表达量分别为88.21%±10.01%、51.22%±6.18%、35.66%±5.09%，与对照组的100%相比，差异均有统计学意义（F值分别为19.76、22.29、18.22、20.87、20.01和18.22，P值均＜0.05）。Matrigel体外侵袭实验及Tranwell小室迁移实验结果显示，对照组过膜细胞数高于普伐他汀处理组过膜细胞数（F值分别为21.09和19.78，P值均＜0.05）。 结论  普伐他汀通过抑制p38活性及p-p38表达、提高MKP-1表达，抑制肝癌HepG2细胞增殖；并通过下调RhoC及MMP-2表达，抑制HepG2细胞侵袭、运动。

【关键词】癌，肝细胞； 肿瘤侵润； 增殖； 普伐他汀

Effects of pravastatin on the proliferation and invasion of human heptocarcinoma HepG2 cell line    ZHANG Wen-jie, YANG Shao-hua, TIAN Shu-ju, LI Zhao-xia, GONG Yan-xuan, QU Yan, MAO Wei-wu. Department of Infectious Diseases, the Second Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China

Email: zhangwenjie718@163.com

【Abstract】 Objective    To observe the effects of pravastatin on the proliferation and invasion of human heptocarcinoma HepG2 cell line. Methods    The effects of pravastatin on the proliferation, migration and invision of HepG2 cells was observed by MTT assay, Boyden chamber assay and motility assay. p38 activity was measured, and the expression of p-p38, MKP-1, RhoC and MMP-2 was analyzed by Western blot. Results    Pravastatin inhibited the proliferation of HepG2 cells. The intracellular p38 activity and expressions of p-p38, RhoC and MMP-2 were decreased, while MKP-1 expression was elevated in pravastatin treated cells. In addition, pravastatin inhibited the invasion and motility. Conclusion    Pravastatin can inhibit the proliferation and invision of HepG2 cells.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Neoplasm invasiveness; Proliferation; Pravastatin

肝癌发病率高居消化系统恶性肿瘤前列，寻找合适的治疗方案是临床关注的重点[1]。他汀类药物是一类降血脂新药，为羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂，对白血病、乳腺癌等细胞的生长具有抑制作用。其主要机制是抑制甲羟戊酸的生物合成和后续的类戊烯的产生及信号蛋白反义后的类戊烯修饰，阻断与细胞生长、分化及运动等相关的信号通路[2-4]。本研究拟使用不同浓度普伐他汀作用于人肝癌细胞株HepG2细胞，检测细胞增殖及侵袭、运动的各项指标，研究其对p38活性和磷酸化p38（p-p38）、丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（mitogen activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1）、RhoC及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的作用。

材料与方法

1．试剂与仪器：HepG2细胞由武汉大学保种中心提供。普伐他汀购自中美上海施贵宝制药有限公司，RPMI 1640培养基、新生牛血清、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司，p38活性测定试剂盒购于美国Chemicon公司，蛋白质标准购于美国New England Biolab公司，小鼠抗p38、MKP-1、RhoC及MMP-2抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠第二抗体、碱性磷酸酶显色试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。流式细胞仪购自美国Beckman公司。

2．细胞培养：HepG2细胞在含10%胎牛血清及青、链霉素各1×105U/L的RPMI1640培养基中贴壁生长，于37℃、5% CO2、95% O2培养箱中传代培养，取第4～6代细胞用于实验。

3．实验分组：收集对数生长期的细胞，以6×105个/ml密度接种于培养瓶，24h换液1次。当细胞达到亚融合状态，无血清培养基培养12h后，将培养的HepG2细胞随机分为对照组和高、中、低浓度普伐他汀组（普伐他汀分别为0.01、0.10、1.00g/L），对照组加入培养基，普伐他汀组加入不同浓度普伐他汀，各瓶终体积均为2ml。12h后收集细胞进行测定。

4.HepG2细胞增殖检测：四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测HepG2细胞增殖情况。消化处于对数增殖期的细胞，以6×105个/孔接种于96孔板，在37℃、5% CO2以及饱和湿度的条件下培养。当细胞达到亚融合状态时，每孔加入200μl无血清培养基，12h后弃培养基。加入不同浓度的普伐他汀及培养基，各孔终体积均为200μl。2d后弃培养基，每孔加MTT溶液（5mg/m1）20μl。孵育4h，每孔加入150μl二甲亚砜，振荡10min，用酶联免疫检测仪读取每孔吸光度（A）值（测量波长620nm，参考波长490nm）。绘制细胞生长曲线，根据公式A实验组/A对照组×100%计算细胞的增殖率和抑制率。

5．p38活性测定：各组取5×105个干预后的细胞，加入5倍体积裂解液孵育20min。取0.5ml蛋白质样品，加入抗p-p38抗体10μl，4℃孵育12h。加入20μl 50%（体积比）蛋白A的琼脂糖，4℃孵育2h。2000×g，4℃离心1min，弃上清液，加入1ml裂解液，4℃孵育10min后离心；重复2次，弃上清液，沉淀蛋白质进行激酶活性测定，在酶标仪450nm处读取A值。并根据标准蛋白质A值绘制的标准曲线计算样本的p38活性，与对照组结果对比。

6．Western blot法检测p-p38、MKP-1、Ras相似物C（ras homologue C，RhoC）和MMP-2蛋白的表达：取40μg总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转移至PVDF膜，封闭后与l∶1000稀释的第一抗体4℃孵育过夜，再与l∶10000稀释的第二抗体室温孵育2h，与增强化学发光试剂温浴5min后曝光、显影和定影，对结果进行吸光度扫描分析，并与对照组结果进行对比。

7．Matrigel侵袭实验：取对数生长期HepG2细胞，用无血清RPMI1640培养液洗涤3次，制成1×106个/ml的单细胞悬液，将上述配制的各组细胞悬液100μl，分别加入Transwell小室中，将小室置入加有RPMI1640培养液的24孔培养板中培养24h待细胞贴壁后，吸弃上层培养液，加入含不同浓度普伐他汀的培养液300μl，每一浓度设3个复室，以等量无药液培养液为对照，置入培养箱中培养12h。取出小室，弃培养液，棉头拭子擦拭小室上层Matrigel胶及未侵袭的细胞，取下Transwell微孔滤膜在4%甲醛溶液中固定30min，常规HE染色。400倍光镜下观察，随机取5个高倍视野，计数透膜细胞总数。

8．Transwell小室迁移实验：体外迁移实验的步骤，除在Transwell小室的上层没铺上一层Matrigel胶以重建基底膜的区别外，其余的具体步骤同侵袭实验。

9. 统计学处理：所有数据均以均数±标准差（x-±s）表示，数据分析采用SPSS10.0统计软件包进行方差分析，各浓度组与对照组之间采用Dunnett-t法进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1．普伐他汀对HepG2细胞增殖的影响：普伐他汀处理后，各组细胞增殖率较对照组明显下降。对照组A值为1.811±0.212，低、中、高浓度普伐他汀组A值分别为1.621±0.256、1.368±0.178、1.177±0.133（F＝18.29，P＜0.05）。对照组HepG2细胞增殖率为100%，低、中、高浓度普伐他汀组增殖率分别为89.51%±9.55%、75.53%±8.33%、64.99%±7.87%，与对照组相比，差异有统计学意义（F＝19.76，P＜0.05）。

2. 普伐他汀对HepG2细胞p38活性的影响：不同浓度普伐他汀处理细胞后，p38活性明显降低。对照组p38活性为100%，低、中、高浓度普伐他汀组p38活性分别为87.45%±8.22%、73.18%±8.32%、60.11%±7.21%，与对照组相比，差异有统计学意义（F＝22.29，P＜0.05）。

3．普伐他汀对HepG2细胞p-p38及MKP-1表达的影响：对照组p-p38表达量为100%，低、中、高浓度普伐他汀组p-p38表达量分别为83.18%±10.71%、49.83%±6.36%、30.70%±4.66%，与对照组相比，差异有统计学意义（F＝18.22，P＜0.05）；对照组MKP-1表达量为100%，低、中、高浓度普伐他汀组MKP-1表达量分别为127.89%±15.38%、153.96%±18.99%、182.63%±20.21%，与对照组相比，差异有统计学意义（F＝20.87，P＜0.05），见图1。以上结果显示，普伐他汀能抑制p-p38的表达，同时增强MKP-1的表达。

4．普伐他汀对HepG2细胞Matrigel体外侵袭力的影响：对照组过膜HepG2细胞数为（289±27）个。药物干预组随着药物浓度的提高，HepG2细胞过膜数逐渐减少，低、中、高、浓度普伐他汀组过膜细胞数分别为（245±29）个、（178±22）个、（112±18）个，与对照组相比，差异有统计学意义（F＝21.09，P＜0.05），表明普伐他汀可抑制HepG2细胞对体外模拟的基底膜的侵袭力。

5．普伐他汀对HepG2细胞Tranwell小室迁移力的影响：对照组过膜HepG2细胞数为（339±41）个。药物干预组随着药物浓度的提高，HepG2细胞过膜数量减少，低、中、高浓度普伐他汀组过膜细胞数分别为（270±30）个、（182±19）个、（120±15）个，与对照组相比，差异有统计学意义（F＝19.78，P＜0.05），表明普伐他汀可抑制HepG2细胞的体外迁移运动能力。

6．普伐他汀对HepG2细胞RhoC及MMP-2表达的影响：对照组RhoC表达量为100%，低、中、高浓度普伐他汀组RhoC表达量分别为81.08%±9.66%、57.11%±7.89%、33.65%±4.78%，与对照组相比，差异有统计学意义（F＝20.01，P＜ 0.05）；对照组MMP-2表达量为100%，低、中、高浓度普伐他汀组MMP-2表达量分别为88.21%±10.01%、51.22%±6.18%、35.66%±5.09%，与对照组相比，差异有统计学意义（F＝18.22，P＜0.05），见图2。以上结果显示普伐他汀能抑制RhoC及MMP-2蛋白表达。

讨    论

他汀类药物是80年代后期开发的一种新型调节血脂药物，这类药物作用的靶位是羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶——胆固醇合成限速酶。近年研究结果表明，他汀类药物除具有降胆固醇的作用外，对多种肿瘤细胞有抑制增殖、诱导分化或凋亡、降低侵袭转移能力、增强放射治疗和化学治疗疗效等作用，是一种潜在的抗肿瘤药物。

p38属于丝裂原活化蛋白激酶家族，可被多种生长因子、细胞因子激活，参与调节细胞增殖与分化。p38活化后通过转录调节引起多种癌基因相继激活导致细胞恶性转化，在细胞生长、发育、分裂、死亡及恶性转化等过程中起重要作用[4-8]。普伐他汀可抑制多种肿瘤细胞增殖[9-10]。本研究利用培养的肝癌细胞株HepG2，以MTT比色法测定不同浓度普伐他汀对细胞增殖的影响，结果显示普伐他汀浓度依赖性抑制HepG2细胞增殖率。同时以p38活性试剂盒测定p38活性，不同浓度普伐他汀处理后，各组p38活性明显降低。进一步用Western blot测定p-p38表达，结果显示各组表达明显降低。对普伐他汀抑制p-p38的机制的研究结果显示，普伐他汀可以提高MKP-1表达，而MKP-1是调节p38的关键酶之一，可使p38去磷酸化失活而起负反馈调节作用，直接影响p38激活的数量和活化的持续时间[11-13]。以上结果均提示普伐他汀抑制HepG2细胞生长作用可能与抑制p38活性，升高MKP-1表达进而降低p-p38表达有关。

RhoC基因的高表达与多种恶性肿瘤的增殖、浸润转移和预后有关[14-15]。MMP-2作为基质金属蛋白酶家族重要成员，降解基质膜成分Ⅳ型胶原主要酶，在癌细胞浸润转移过程中起重要作用[16-17]。本实验通过Matrigel侵袭实验及Transwell小室迁移实验发现，对照组HepG2细胞透膜较多，体外运动能力较强；经普伐他汀处理过的肝癌HepG2细胞穿透Matrigel胶和透过微孔滤膜向下室转移的细胞数目均明显减少，且随着普伐他汀浓度的提高透膜细胞数目逐渐减少。进一步用Western blot研究普伐他汀对RhoC及MMP-2表达的影响，结果显示普伐他汀可抑制RhoC及MMP-2表达。普伐他汀抑制体外培养HepG2细胞的侵袭和迁移能力是通过抑制RhoC及MMP-2表达实现的，这也可以解释其具有抗肿瘤的作用。

普伐他汀抑制HepG2细胞增殖的机制与抑制p38活性及p-p38表达有关，抑制HepG2细胞侵袭和迁移能力的机制与抑制RhoC及MMP-2的表达有关。然而，以上结果尚不能排除普伐他汀对其他信号通路的作用，同时也需进一步在体内实验证实其抗肿瘤作用。在进一步的实验中，我们将观察其他他汀类药物对HepG2细胞株增殖的影响，并探讨其机制。

参  考  文  献

[1]Ye SL. Non-surgical therapy for hepatocellular carcinoma. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 558-560. (in Chinese)

叶胜龙.肝癌的非手术治疗.中华肝脏病杂志,2006,14:558-560.

[2]Alsheikh-Ali AA, Karas RH. The relationship of statins to rhabdomyolysis, malignancy, and hepatic toxicity: evidence from clinical trials. Curr Atheroscler Rep, 2009, 11: 100-104.

[3]Hamilton RJ, Freedland SJ. Rationale for statins in the chemoprevention of prostate cancer. Curr Urol Rep, 2008, 9: 189-196.

[4]Kuoppala J, Lamminp滗 A, Pukkala E. Statins and cancer: A systematic review and meta-analysis. Eur J Cancer, 2008, 44: 2122-2132.

[5]Krishnan AV, Moreno J, Nonn L, et al. Calcitriol as a chemopreventive and therapeutic agent in prostate cancer: role of anti-inflammatory activity. J Bone Miner Res, 2007, 22 Suppl 2: V74-80.

[6]Noel JK, Crean S, Claflin JE, et al. Systematic review to establish the safety profiles for direct and indirect inhibitors of p38 Mitogen-activated protein kinases for treatment of cancer. A systematic review of the literature. Med Oncol, 2008, 25: 323-330.

[7]Hui L, Bakiri L, Stepniak E, et al. p38alpha: a suppressor of cell proliferation and tumorigenesis. Cell Cycle, 2007, 6: 2429-2433.

[8]Hoye AT, Davoren JE, Wipf P, et al. Targeting mitochondria. Acc Chem Res, 2008, 41: 87-97.

[9]Wali VB, Bachawal SV, Sylvester PW. Combined treatment of gamma-tocotrienol with statins induce mammary tumor cell cycle arrest in G1. Exp Biol Med (Maywood), 2009, 234: 639-650.

[10]Teresi RE, Planchon SM, Waite KA, et al. Regulation of the PTEN promoter by statins and SREBP. Hum Mol Genet, 2008, 17: 919-928.

[11]Keyse SM. Dual-specificity MAP kinase phosphatases (MKPs) and cancer. Cancer Metastasis Rev, 2008, 27: 253-261.

[12]Wu GS. Role of mitogen-activated protein kinase phosphatases (MKPs) in cancer. Cancer Metastasis Rev, 2007, 26: 579-585.

[13]Johnson GL, Lapadat R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science, 2002, 298: 1911-1912.

[14]Wang W, Wu F, Fang F, et al. Inhibition of invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells via targeting RhoC in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 2008, 14: 6804-6812.

[15]Liu N, Zhang G, Bi F, et al. RhoC is essential for the metastasis of gastric cancer. J Mol Med, 2007, 85 : 1149-1156.

[16]Dutta A, Sen T, Banerji A, et al. Studies on multifunctional effect of all-trans retinoic acid (ATRA) on matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and its regulatory molecules in human breast cancer cells (MCF-7). J Oncol, 2009, 2009: 627840.

[17]Morozevich G, Kozlova N, Cheglakov I, et al. Integrin alpha5beta1 controls invasion of human breast carcinoma cells by direct and indirect modulation of MMP-2 collagenase activity. Cell Cycle, 2009, 8: 2219-2225.

（收稿日期：2009-08-24）

（本文编辑：黄晨）

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