人参皂苷Rg1对纤维化肝脏肝细胞超微结构及其表达基质金属蛋白酶组织抑制剂1的影响

【关键词】肝硬化； 基质金属蛋白酶； 人参皂苷Rg1； 三七总皂甙； 抑制剂

The effect of Panaxsaponin Rg1 on the ultrastructure of hepatocytes and the express of TIMP-1 in hepatic fibrotic mice   MA Lan-qing, DONG Xiang-qian, LIANG Bing, DUAN Li-ping, LI Shu-an, LIU Bo, ZHANG Lin, ZHAN Er-yi, YANG Zhi-wei, ZHANG Zhao-jiu, WEI Yong-min, WU Xiu-juan, JIN De-guang.

【Key words】Liver cirrhosis; Matrix metalloproteinases; Panaxsaponin Rg1; Panax notoginsenosides; Inhibitor

【First author’s address】Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College ,Kunming 650032,China

Email: malanqing@yahoo.com.cn

基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-1随肝纤维化病情的发展表达增强，与基质金属蛋白酶（MMP）-1特异性结合，使间质胶原酶活性下降，造成细胞外基质（ECM）沉积增加，促进肝纤维化进一步发展。三七可以增强胶原酶活力，降解肝内的Ⅰ、Ⅲ型胶原，其发挥作用的主要成分为三七总甙[1]；而三七总甙是一种混合物，含人参皂苷共7种，人参皂苷Rg1为其中主要成分之一。前期研究表明，人参皂苷Rg1对肝纤维化有明显的治疗作用[2]。本研究通过RT-PCR检测人参皂苷Rg1对CCl4所致肝纤维化模型大鼠肝组织TIMP-1 mRNA及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，以探讨其抗肝纤维化的可能机制。

一、材料与方法

1．药物：三七总苷Rg1、三七总甙由昆明医学院重点实验室分离提纯，纯度>95%。

2. 动物：健康SD大鼠65只，体质量（180±20）g，雌鼠33只，雄鼠32只，购自昆明医学院动物科，动物合格证号：SCXK（滇）2005-0008。

3. 主要试剂：E.Z.N.A.甌otal RNA试剂盒购自美国Omega公司；cDNA合成试剂盒购自日本TOYOBO公司；Taq酶、4×dNTP购自上海Sangon公司；DNA相对分子质量标准购自北京天为时代公司。CCl4（分析纯品）购自上海化学试剂公司；秋水仙碱购自昆明制药集团股份有限公司。Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）放射免疫试剂盒购自上海海军研究所。

4. 肝纤维化大鼠模型的建立：CCl4用橄榄油配制成50%溶液，首剂3ml/kg皮下注射，之后2ml/kg皮下注射，每周2次，共10次。大鼠随机分为6组：三七总甙组10只（60mg·kg-1·d-1）、Rg1高剂量组10只（120mg·kg-1·d-1）、Rg1中剂量组10只（60mg·kg-1·d-1）、秋水仙碱组10只（0.2mg·kg-1·d-1）、等渗盐水组10只（2ml/只）和正常对照组15只，造模开始时即予颈部皮下连续注射治疗药物，治疗35d。经切断腹股沟动脉处死剩余大鼠，取肝脏左叶，一部分肝组织置于2.5%戊二醛溶液中，用于电子显微镜检查；一部分置于-70℃超低温冰箱保存备用。

5. RT-PCR检测肝组织TIMP-1 mRNA的表达：（1）肝组织RNA提取：参照E.Z.N.A.甌otal RNA试剂盒说明书进行，取RNA溶液各2μl，以500μl DEPC处理过的d2H2O稀释，取稀释液各100μl在分光光度计上测得RNA样品的A260/A280值为1.8～2.0；调整RNA浓度至终浓度为5μg/ml，置-70℃保存。（2）cDNA的合成：20μl逆转录反应体系：5×缓冲液4μl、4×dNTP 2μl (1mmol/L)、RNA酶抑制剂1μl、Oligo(dt)20引物1μl、总RNA 5μl、Rever Tra Ace 1μl，无RNA酶H2O补至20μl。PCR条件：30℃ 10min，42℃ 55min，99℃ 5min，灭活逆转录酶；-20℃保存待用。（3）定量PCR：在GenBank里查找基因序列后用primer premer 5.0软件设计，引物序列如下:Ⅰ型胶原（471bp）上游为5′-CCGTGGTGACAAGGGT GAGACAG-3′，下游为5′-TCAGGGCTGCGGATGTT CTCA-3′；TIMP-1（218bp）上游为5′-CCACAGGTTT CCGGTTCGCCTACA-3′，下游为5′-GCACACCCCAC AGCCAGCACTAT-3′；3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，650bp）上游为5′-GATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′，下游为5′-TCATTGAGAGCAATGCCAGC-3′。经基因文库核对无误后，交由北京优博基因科技有限公司合成。反应体系为50μl：cDNA 4μl、MgCl2 3μl、10×Taq缓冲液5μl、4×dNTP 2μl、Taq酶1μl、上下游引物各1μl，加d2H2O补至50μl。PCR条件：95℃ 150s；Ⅰ型胶原（94℃ 5s，66℃ 30s，72℃ 45s，共26个循环；94℃ 35s，53℃ 30s，72℃ 45s，共15个循环；72℃延伸7min）；TIMP-1（94℃ 35s，69℃ 30s，72℃ 45s，共22个循环；94℃ 35s，53.6℃ 30s，72℃ 45s，共19个循环；72℃ 7min）；GAPDH（94℃ 35s，59.1℃ 30s，72℃ 35s，共26个循环；72℃ 7min）。（4）扩增产物定量分析：扩增产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳，用Genetool分析系统对电泳条带进行扫描定量分析。用TIMP-1/GAPDH比值表示TIMP-1 mRNA的相对表达量，Ⅰ型胶原/GAPDH比值表示Ⅰ型胶原mRNA的相对表达量。

6. 统计学分析：所有数据用SPSS13.0统计软件包进行处理分析。计量资料均以均数±标准差（x-±s）表示。数据均进行正态性及方差齐性检验。计量资料的多组数据比较采用完全随机设计方差分析。检验水准α=0.05。

二、结果

1. 大鼠存活情况：至实验结束，Rg1高剂量组、三七总甙组、秋水仙碱组各死亡1只，其余大鼠全部存活。

2. 各组大鼠肝组织的超微结构：等渗盐水组大鼠肝脏见肝细胞内大量大小不等的脂质空泡变性，部分肝细胞胞质水肿，可见脂褐素沉着，线粒体可见增生肥大、肿胀，少数可见核固缩，部分细胞内线粒体残体增多，基质颗粒减少，甚至出现致密、边界不清的絮状物，内质网成囊状扩张，并脱颗粒；肝血窦可见淤血、扩张；Disse间隙变窄，可见胶原纤维增生，肝细胞Disse间隙面微绒毛减少、稀疏（图略）。三七总甙组、Rg1各剂量组大鼠肝脏超微结构基本同正常对照组，程度明显较等渗盐水组轻（图略）。

3. 大鼠肝组织中TIMP-1 mRNA、Ⅰ型胶原mRNA的表达情况：Rg1高剂量组、三七总甙组的TIMP-1 mRNA表达水平较等渗盐水组明显下降，差异有统计学意义（F＝57.326，P<0.01）；Rg1高剂量组、三七总甙组较Rg1中剂量组也有下降，差异有统计学意义（F＝23.537，P<0.01）；Rg1中剂量组、秋水仙碱组、等渗盐水组明显高于正常对照组，差异有统计学意义（F＝18.230，P<0.01）。Rg1高剂量组、三七总甙组的I型胶原mRNA表达水平较等渗盐水组明显下降，差异有统计学意义（F＝165.723，P<0.01）；Rg1高剂量组较Rg1中剂量组也有下降，差异有统计学意义（F＝102.632，P<0.01）；Rg1中剂量组、秋水仙碱组、等渗盐水组亦明显高于正常对照组，差异有统计学意义（F＝231.500，P<0.01）。见图4，表1。

表1  各组大鼠Ⅰ型胶原和TIMP-1 mRNA表达水平

比较（x-±s）

名称      大鼠数(只)       Ⅰ型胶原          TIMP-1

Rg1高剂量组 9    1.65±0.85abc       (2.53±0.86)×10-1ab

Rg1中剂量组 10    3.46±0.47d   (5.94±0.98)×10-1d

三七总甙组    9    1.77±0.89ac  (2.96±0.83)×10-1ab

秋水仙碱组    9    2.44±0.26ad  (3.94±1.18)×10-1abd

等渗盐水组    10    4.82±0.51d   (7.33±2.45)×10-1d

正常对照组    15    0.79±0.27     (1.41±0.73)×10-1

  注：TIMP-1：基质金属蛋白酶组织抑制剂-1；a 与等渗盐水组比较，Ⅰ型胶原：F＝165.723，P<0.01，TIMP-1：F＝57.326，P< 0.01；b 与Rg1中剂量组比较，Ⅰ型胶原：F＝102.632，P<0.01，TIMP-1：F＝23.537，P<0.01；c 与正常对照组比较，Ⅰ型胶原：F＝147.100，P<0.05；d 与正常对照组比较，Ⅰ型胶原：F＝231.500，P<0.01，TIMP-1：F＝18.230，P<0.01

三、讨论

肝纤维化是完全有可能逆转的[3]。阻断肝纤维化的形成和发展对于防治肝硬化具有重要意义。近20多年来，国内外学者对三七进行了广泛的研究，从临床、体内实验证实了它具有抗脂质过氧化、改善肝脏微循环、抑制肝脏胶原合成和促进胶原降解，从而抗肝纤维化的作用。三七对肝纤维化的作用主要由其主要成分三七总甙发挥，三七总甙的主要成分之一为Rg1，其有明确的抗肝纤维化作用[2]。但其作用机制尚不明确。另有研究结果表明，三七对肝损伤肝纤维化的超微结构改变具有显著的防治作用[4]。而三七总甙及其单体Rg1对肝纤维化超微结构的影响尚鲜见报道。

本研究结果显示，三七总甙和人参皂苷Rg1用于实验性肝纤维化可改善肝组织超微结构，减轻肝细胞脂肪空泡变性程度，减少Disse间隙及肝星状细胞周围的胶原纤维沉积，促进已形成胶原的吸收。三七总甙及其单体成分Rg1高剂量组能明显降低肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1 mRNA和Ⅰ型胶原mRNA的表达，提示抑制TIMP-1表达有助于三七总甙及其单体Rg1发挥抗纤维化的作用。

由此可见，三七总甙具有抗肝纤维化的作用，而其主要单体成分Rg1是其抗肝纤维化作用的有效成分；下调肝组织TIMP-1 mRNA的表达可能是人参皂苷Rg1及三七总甙抗肝纤维化作用的机制之一。

参  考  文  献

[1]Shi XF, Xu M, Liu Q. The effects of Total Saponins of Panax Notoginseng on I, III-type collage and TGF-β1 in l iver of cirrhosis rats. Zhongyao Yaoli Yu Linchuang, 2001, 17: 7-8. (in Chinese)

石小枫,徐曼,刘杞.三七总皂甙对肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的影响.中药药理与临床,2001,17:7-8.

[2]Ma LQ, Liang B, Liu B, et al. Experimental study of Panaxsaponin Rg1 on hepatic f ibrosis in rats. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Xiaohua Zazhi, 2007, 15: 165-168. (in Chinese)

马岚青，梁兵，柳波，等.人参皂苷Rg1抗肝纤维化的实验研究. 中国中西医结合消化杂志,2007,15:165-168.

[3]Mann DA, Smart DE. Transcriptional regulation of hepatic stellate cell activation. Gut, 2002, 50: 891-896.

[4]Liu BY, Gao LX, Yang XM, et al. The prevention and treatment of the notoginseng against hepatic fibrosis in rats. Zhongxiyi Jiehe Ganbing Zazhi, 1998, 8(zengkanshang): 113-115. (in Chinese)

刘宝源,高连相,杨西敏,等.三七对小鼠肝损伤肝纤维化的防治作用.中西医结合肝病杂志,1998,8(增刊上):113-115.

（收稿日期：2009-09-14）

（本文编辑：朱红梅）

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