超声微泡包裹单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶自杀基因靶向治疗小鼠肝癌的效果

【摘要】目的  观察超声微泡携单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV1-TK）基因在小鼠肝癌细胞H22移植瘤组织中的转染效果及联合更昔洛韦（GCV）后对肿瘤的抑瘤效应。 方法  建立小鼠肝癌（H22）皮下移植瘤模型40只，随机分成4组，分别经鼠尾静脉注射入等量磷酸盐缓冲液（A组）、HSV1-TK（B组）、HSV1-TK（C组）、HSV1-TK+微泡（D组），每次注射200μl，每隔3d注射1次，共注射3次；对C组、D组小鼠分别给予1MHz、2W/cm2、5min超声辐照。首次注射HSV1-TK 48h后采用Western blot检测肿瘤组织中TK蛋白的表达情况，且各治疗组分别从腹腔注射GCV 0.2ml（100mg·kg-1·d-1），连续注射14d。测肿瘤大小，计算抑瘤率，治疗结束后处死动物行病理学检查。数据采用重复测量资料的方差分析，两两比较采用LSD-t法。 结果  在超声引导下微泡包裹的HSV1-TK基因可以准确定位于肿瘤组织并靶向释放，在处理组中均有TK蛋白的表达，其中D组表达量明显高于其他各组（P<0.05）。抑瘤率在A组、B组、C组、D组中分别为0、3.90%±1.80%、22.70%±2.86%、41.25%±3.20%（C组、D组与B组相比，P值均<0.05；D组与C组相比，P<0.05）。HE染色结果显示D组较A组的坏死病变程度明显减轻。 结论  超声辐照可破坏包裹HSV1-TK基因的微泡以定位释放，既增加了肝癌基因治疗的靶向性，又提高了外源基因的转染效率，从而增强了自杀基因对小鼠肝癌的杀伤效果。

【关键词】癌，肝细胞； 基因，HSV1-TK； 超声微泡

Effect of ultrasound microbubble carring herpes simplex virus thymidine kinase on hepatocellular carcinoma in mice   ZHOU Shi-ji, LIU Chang-an, GONG Jian-ping, LIU Zuo-jin, TANG Yong, LI Sheng-wei, XU Yue, AI Zhi-guo. Department of Hepatobiliary Surgery, the Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical  University, Chongqing 400010, China

Corresponding author: LI Sheng-wei, Email: cqlsw@yahoo.com.cn

【Abstract】 Objective    To observe the effect of ultrasound microbubble carring herpes simplex virus thymidine kinase hepaocellular carcinoma in mice. Methods    Kunming mice were inoculated subcutaneously with H22 tumor cells. 40 male mice bearing subcutaneous hepatoma were randomized into 4 groups: PBS (groupA),  HSV1-TK (group B), HSV1-TK(group C), and microbubble carring HSV1-TK ( group D) were injected into the tail vein every 3 days. Mice in group C and D were exposed to ultrasound. The expression of TK protein was detected by western blot. Ganciclovi (GCV) was intraperitoneally injected at a dose of 100 mg . kg-1 . d-1 in group B, group C and group D. The tumor size was measured every 2 days. Results    TK gene could be injected precisely into hepatocellular carcinoma with ultrasound monitor, and the expression of TK protein was found in all 4 groups. Expression in group D was higher than others (P < 0.05). The rate of tumor growth inhibition were 0 in group A, 3.90%±1.80% in group B, 22.70%±2.86% in group C, 41.25%±3.20% in group D (group B vs group C, P < 0.05; group D vs group C, P < 0.05; groupD vs group B, P < 0.05). Conclusions    Ultrasound microbubble not only improve target gene therapy, but also enhance transfection efficiency. 

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Gene, herpes simplex virus type I-thymidine kinase; Ultrasound microbubble

目前肝癌的基因治疗已成为研究的热点之一。其中自杀基因治疗系统，特别是单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/更昔洛韦（herpes simplex virus typeⅠ-thymidine kinase/ganciclovir，HSV1-TK/GCV）系统在治疗肿瘤方面已显示出了较好的应用前景，但由于其病毒载体的安全性及非病毒基因载体的低效性等问题限制其进一步发展。最近，出现的一种新的基因靶向转染技术—超声破坏携靶基因的微泡定向释放技术有望成为解决基因治疗肿瘤中存在的诸多问题。本研究以超声微泡包裹HSV1-TK自杀基因在小鼠肝癌组织中靶向释放，并用超声、微泡特点以提高基因的转染效率，加之自杀基因的旁观者效应充分发挥其抑瘤作用，为进一步联合其他物理方法治疗肝癌提供前期研究基础。

材料与方法

1. 实验动物及细胞株：昆明种小鼠40只，清洁级，体质量（20±2）g，雄性，6～8周龄，购自解放军第三军医大学实验动物中心；小鼠肝癌H22细胞株由重庆医科大学超声影像学研究所惠赠。

2. 主要仪器及试剂：752型紫外分光光度仪购自日本岛津公司，CGZZ型超声基因转染治疗仪(1MHz)为重庆医科大学超声影像学研究所研制，自制脂质微泡为重庆医科大学超声影像学研究所惠赠。pIRES2-EGFP-HSV1TK质粒为本课题组前期研究合成[1]。GIGA质粒试剂盒购自美国Qiagen公司，多聚赖氨酸购自美国Sigma公司，GCV购自瑞士Roche公司。RPMI 1640购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；TK1多克隆抗体购自英国Abcam公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体购自美国GenScript公司，内参照肌动蛋白购自美国GenScript公司。

3. 小鼠移植瘤模型的建立：取体外培养生长状态良好的H22细胞，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×108个/ml，锥虫蓝拒染试验检测显示细胞活力>90%。取0.2ml接种于昆明种小鼠右侧背部皮下，6d后肿瘤直径达0.5～1.0cm，成瘤率为100%。实验动物随机分成4组：磷酸盐缓冲液（PBS，A）组、HSV1-TK（B）组、HSV1-TK+超声辐照（C）组、HSV1-TK+微泡+超声辐照（D）组，每组10只。

4. 质粒提取及包裹HSV1-TK基因微泡的合成：pIRES2-EGFP-HSV1TK质粒转化DH5a大肠杆菌；经卡那霉素筛选出阳性克隆，在LB培养基中大量扩增细菌；参照GIGA质粒抽提试剂盒说明书大量抽提纯化质粒；紫外分光光度计检测质粒浓度和纯度，调整浓度为1mg/ml，A260/A280＝1.9，其纯度符合实验要求。参照文献[2]的方法制备载有HSV1-TK基因及赖氨酸的超声微泡造影剂，调整浓度为0.1μg/μl。

5. 治疗方法：第6天开始经鼠尾静脉注射入包裹有HSV1-TK的微泡，每次200μl，每3d注射1次，连续注射3次。A组：PBS 200μl；B组：HSV1-TK 200μl （0.1μg/μl）；C组：超声辐照+HSV1-TK 200μl（0.1μg/μl）；D组：HSV1-TK+超声辐照+微泡200μl（0.1μg/μl）。C组、D组注射入目的基因后采用超声监测微泡到达靶组织的情况，然后调整辐照频率为1MHz、声强为2W/cm2进行辐照，时间5min；辐照结束后48h经腹腔注射GCV 0.2ml（100mg·kg-1·d-1），连续注射14d。

6. 检测指标：（1）定期测肿瘤大小计算抑瘤率：在治疗期间每2d使用游标卡尺测肿瘤的最长径a（mm）、最短径b（mm），并采用公式V=ab2/2计算肿瘤的体积，单位为mm3，抑瘤率=（A组肿瘤平均体积-治疗组肿瘤平均体积）/A组肿瘤平均体积×100%，根据测量肿瘤体积的大小绘制表格（此处治疗组为B、C、D组）。并观察小鼠生长情况，如活动能力、毛发、营养、肿瘤转移情况等。（2）Western blot检测TK蛋白的表达情况：转染48h后，活杀一批小鼠采用Western blot检测TK蛋白的表达情况，操作按常规方法进行：收集小鼠肿瘤组织，提取总蛋白，-20℃保存。40ml/L浓缩胶，100ml/L分离胶，预染蛋白相对分子质量标准3.0μl，样本总蛋白20μg/孔，加样至100ml/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，60V，30min；100V，90min，溴酚蓝移至胶最下面时取胶。同步化将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜，20V、50min。转膜后以50ml/L脱脂奶粉Tris缓冲盐溶液室温下封闭4h；加入第一抗体TK1（1∶500），室温孵育2h, 4℃过夜。Tris缓冲盐溶液洗膜3次，15min/次，加入HRP标记的第二抗体（1∶5000），室温下轻摇孵育2h；洗膜、显影、曝光。采用UVP凝胶图像处理系统Labworks4.6软件分析目的条带与内参照β-肌动蛋白的灰度值比值。（3）肿瘤组织病理学检查：治疗结束后处死小鼠，取出肿瘤组织用甲醛溶液固定，常规石蜡切片；HE染色，观察肿瘤组织的病理学变化情况，了解肿瘤组织坏死及炎症细胞浸润情况。

7. 统计学分析：数据采用均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS13.0统计软件进行重复测量资料的方差分析，两两比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. HSV1-TK基因靶向释放及转染48h后TK蛋白表达情况：包裹有目的基因的微泡到达靶组织后采用超声波击破微泡使目的基因得以定向释放（图1）。转染48h后HSV1-TK+微泡+超声辐照（D）组TK蛋白表达量明显高于其他各组（P< 0.05），见图2。

2. 小鼠及小鼠肝癌皮下移植瘤的生长情况：随着肿瘤的增大，小鼠明显消瘦，食欲减退，被毛失去光泽，活动减少，体质量减轻等，但联合GCV治疗组（C、D组）在治疗后小鼠的生长状态明显好于对照组。各组荷瘤鼠经治疗后，A组、B组、C组、D组的抑瘤率分别是0、3.90%±1.80%、22.70%±2.86%、41.25%±3.20%（表略）。D组与其他各治疗组比较，其抑瘤效应更加明显（D组与C组相比，t＝161.29，P<0.05；D组与B组相比，t＝323.71，P<0.01）；C组与B组相比，t＝162.43，P<0.05；A组与B组相比，差异无统计学意义（t＝28.96，P>0.05）,见表略。

3. 治疗后第28天肿瘤组织的病理学变化：光学显微镜下对照组肿瘤细胞较多，密集，大小不一，排列紊乱，核大深染，肿瘤组织中有坏死的肿瘤细胞，呈核固缩表现，并见小片状均质红染无结构的肿瘤坏死组织，周边有少量的炎性细胞浸润；而联合GCV治疗组肿瘤坏死细胞较对照组多，核固缩表现明显，大片均质状无结构的坏死区域较对照组广，肿瘤周边炎性细胞浸润较多（图略）。

讨    论

肝癌的基因治疗需要一种无创、高效、靶向性好的基因转染技术，而超声波破坏携靶基因的微泡定位释放技术不失为一种较好的物理基因转染方法。用超声波监测并在特定的时间和空间击碎靶组织内的微泡，实现基因治疗的精确性和靶向性；超声波作用于微泡产生的空化效应和机械效应能增加靶区细胞膜通透性及血管内皮细胞间隙增宽，使得外源基因更容易进入靶组织，而且在一定的超声辐照条件下，超声既不破坏转染基因，又可提高靶基因的转染效率[3-4]。本研究用超声及微泡的特点成功监测到微泡到达靶组织的影像，并击碎微泡使靶基因得以定位释放。在转染48h后超声+微泡+HSV1-TK组TK蛋白表达水平最高，再次证明了该技术能显著提高目的基因的转染效率。

超声波破坏微泡进行基因转染是一种瞬时转染方法，基因在组织中表达的时间比较短，而不像其他病毒介导的外源基因的表达可持续较长时间。Aoi等[5]发现采用该方法转染的目的基因在转染48h后开始出现明显衰减，这可能与质粒DNA转染后迅速降解有关。我们采用多次给予HSV-TK基因方式，旨在克服瞬时转染中外源基因不能持续表达的缺点。通过多次给予目的基因的方法也显示其对肿瘤的治疗有较大帮助。同时大量的研究结果表明：微泡是一种安全、可重复使用且不会引起免疫反应的载体，故这为本研究重复给予基因提供了有利保障[6]。

本研究采用的HSV1-TK自杀基因是一种前药酶基因，它可将无毒的前药GCV经磷酸化作用转化成细胞毒性药物，从而对肿瘤起着杀伤作用；未被转染的细胞还可通过其旁杀作用来杀伤肿瘤细胞。目前该系统在旁观者效应及如何增加其对前药的敏感性方面已成为近年来研究的热点。大量研究结果提示可通过下面几种途径提高该系统对肿瘤的杀伤能力：（1）联合其他药物增加其对前药的敏感性或增加前药的浓度；（2）增强其免疫能力提高自杀基因的旁观者效应；（3）增加肿瘤细胞间的间隙或上调细胞连接蛋白等来提高旁观者效应[7]。超声微泡作为一种药物或基因的载体，具有无毒、可反复使用、无免疫原性、相对靶向性等优点，可用来增强该系统对肝癌的杀伤能力；并用超声波破坏微泡产生的空化效应和机械效应以增加肿瘤组织间的细胞间隙，从而进一步提高旁观者效应，这为后续微泡包裹药物或基因联合其他物理手段治疗肝癌提供了很好的基础。

参  考  文  献

[1]Tang Y, Liu ZJ, Zhou SJ, et al. Construction and expression of enhanced green fluorescent protein and HSV1-TK co-expression vector. Zhongguo Shiyong  Waike Zazhi, 2009, 29: 937-940. (in Chinese)

唐勇,刘作金,周世骥,等.增强型绿色荧光蛋白与单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶共表达质粒载体构建及在肝癌细胞株HepG2表达的研究.中国实用外科杂志,2009,29:937-940.

[2]Wang ZX, Wang ZG, Xu CS, et al. Experimental study on preparation of lipid ultrasound microbubbles loaded gene and polylysine. Zhongguo Chaosheng  Yixue Zazhi, 2009, 25: 101- 104. (in Chinese)

汪朝霞,王志刚,许川山,等.一种载基因及多聚赖氨酸的脂质超声微泡造影剂制备的实验研究.中国超声医学杂志,2009,25:101-104.

[3]Tian L, Zhao GQ, Yuan JJ, et a1.Effect of TIMP-1 siRNA on liver fibrosis in rats under ultrasound microbubble and ultrasound irradiation. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2007, 15: 865-866. (in Chinese)

田力,赵国强,袁建军,等.超声微泡联合超声辐射介导基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA抗大鼠肝纤维化的作用.中华肝脏病杂志,2007,15:865-866.

[4]Zhang Q, Wang Z, Ran H, et al. Enhanced gene delivery into skeletal muscles with ultrasound and microbubble techniques. Acad Radiol, 2006, 13: 363-367.

[5]Aoi A, Watanabe Y, Mori S, et al. Herpes simplex virus thymidine kinase-mediated suicide gene therapy using nano/microbubbles and ultrasound. Ultrasound Med Biol, 2008, 34: 425-434.

[6]Pitt WG, Husseini GA, Staples BJ. Ultrasonic drug delivery--a general review. Expert Opin Drug Deliv, 2004, 1: 37-56.

[7]Gentry BG, Boucher PD, Shewach DS. Hydroxyurea induces bystander cytotoxicity in cocultures of herpes simplex virus thymidine kinase-expressing and nonexpressing HeLa cells incubated with ganciclovir. Cancer Res, 2006, 66: 3845-3851. 

（收稿日期：2009-11-15）

（本文编辑：朱红梅）

中华肝脏病杂志