阻断程序性死亡蛋白1及其配体信号通路增强慢性乙型肝炎病毒感染小鼠的抗病毒免疫

【摘要】目的  建立慢性HBV感染的小鼠模型, 体内阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强模型小鼠的抗病毒免疫，探寻慢性乙型肝炎治疗的新方法。 方法  以流体动力学法给C57BL/6小鼠尾静脉注射pAAV/HBV1.2-GFP，不同时间点检测血清和组织中各种HBV标志物的表达。给模型小鼠腹腔注射抗PD-L1的单克隆抗体，检测小鼠血清ALT和HBV DNA载量的变化。两计量资料比较采用t检验。 结果  成功建立慢性HBV感染小鼠模型, 建模90d后仍能检测到血清HBsAg的表达及高载量的HBV DNA。体内阻断PD-1/PD-L1信号通路后，小鼠血清ALT水平明显上升（t＝5.436, P<0.01），同时，血清HBV DNA载量显著下降，t＝4.919，P<0.01，差异有统计学意义。 结论  慢性HBV感染小鼠模型是研究HBV感染免疫耐受机制及治疗方法较好的工具；体内阻断PD-1/PD-L1信号通路，能增强慢性HBV感染小鼠的抗病毒免疫，可能成为慢性乙型肝炎治疗的新策略。

【关键词】肝炎病毒，乙型； 流体动力学； PD-1/PD-L1； 信号通路

Enhancement of antiviral immunity in HBV mouse model by blocking PD-1/PD-L1 signaling pathway    WENG Zhi-hong, YE Pian, ZHANG Shu-ling. Department of Infectious Diseases, Xiehe Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022,China

Corresponding author: ZHANG Shu-ling, Email: baihuasheshecao@yahoo.com.cn

【Abstract】 Objective    To establish a mouse model for human chronic HBV infection, and to investigate the role of PD-1/PD-L1 signaling pathway in  antiviral immunity. Methods    A mouse model was established by hydrodynamic injection of the plasmid pAAV/HBV1.2-GFP into the tail vein of C57BL/6 mice, HBV markers were assayed at different time points after injection. After intraperitoneal injection of anti-PD-L1 monoclonal antibody, the serum ALT, and HBV DNA in the serum, liver and kidney were assayed. Results    The chronic HBV infection mouse model were established successfully, serum HBsAg and high load of HBV DNA were detectable 90 days after plasmid injection. After blocking of the PD-1/PD-L1 pathway, the serum ALT level of mice were significantly increased (P < 0.01), and the HBV DNA load in serum (P < 0.01), liver (P < 0.05) and kidney (P < 0.05) were decreased significantly. Conclusion    Blocking the PD-1/PD-L1 signaling pathway can enhance antiviral response in mice with chronic HBV infection.

【Key words】Hepatitis B virus; Hydrodynamics; PD-1/PD-L1; Signaling pathway

研究表明，持续高HBV DNA水平的慢性HBV感染者，肝硬化和肝细胞癌的发病率显著上升[1-2]。因此，最大限度持久抑制或清除病毒，对改善慢性HBV感染者的生活质量和延长存活时间有极为重要的意义。近年来，程序性死亡蛋白-1（programmed death 1，PD-1）及其配体（PD-L1）信号通路与HBV感染慢性化的关系引起学者们关注，本研究拟通过体内阻断PD-1/PD-L1途径，增强慢性HBV感染小鼠的抗病毒免疫，探寻慢性乙型肝炎治疗的新方法。

材料与方法

1. 材料：含有1.2倍HBV全基因组的腺相关病毒载体pAAV/HBV1.2-GFP由台湾大学医学院陈培哲教授惠赠。6～8周岁雄性无特定病原级C57BL/6小鼠购自华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所。兔抗-HBs和抗-HBc购自美国ebioscience公司，辣根过氧化物酶购自丹麦DAKO公司，抗PD-L1单克隆抗体和对照抗体IgG2a购自美国ebioscience公司。

2．方法：（1）模型的建立：正常C57BL/6小鼠随机分为两组，实验组和对照组各10只。按照Huang等[3]的流体动力法给C57BL/6小鼠尾静脉注射腺相关病毒载体pAAV/HBV1.2-GFP，每只小鼠注射10μg的pAAV/HBV1.2-GFP（溶于8%小鼠体质量相当体积的磷酸盐缓冲液中），5s内完成注射；对照组尾静脉注射8%小鼠体质量相当体积的磷酸盐缓冲液。（2）生物化学指标分析：在建模后及给予干预的不同时间点，取小鼠血清测定ALT水平。（3）组织病理和免疫组织化学检测：建模前及建模成功后，针刺法取肝活体组织。肝组织切片进行苏木素和伊红染色，免疫组织化学法检测肝内HBsAg和PD-L1蛋白的表达。（4）血清HBsAg和HBV DNA检测：建模后不同时间点收集小鼠血清样本，检测HBsAg表达；同时应用实时荧光定量PCR法检测血清HBV DNA载量。PCR引物对序列如下：正义为5′-ATCCTGCTGCTATGCCT CATCTT-3′，反义为5′-ACAGTGGGGGAAAGC CCTACGAA-3′，荧光探针为5′-TGGCTAGTTT ACTAGTGCCATTTG-3′。（5）阻断体内PD-1/PD-L信号通路的转导：建模90d后，将血清HBsAg及HBV DNA阳性的小鼠10只小鼠随机分为实验组和对照组，每组5只，分别于第1、4天腹腔注射200μg抗PD-L1单克隆抗体或对照抗体IgG2a，干预前，用针刺法取两组小鼠肝活组织检查，干预后14d处死小鼠，免疫组织化学法检测肝内HBsAg表达；同时检测干预前后小鼠血清样本中的HBV DNA和ALT水平。

3. 统计学处理：所测数据用均数±标准差（x-±s）表示，应用SPSS12.0统计软件包分析，两计量资料比较采用t检验（HBV DNA以拷贝数的常用对数值进行分析），P<0.05为差异具有统计学意义。

结    果

1. 慢性HBV感染小鼠模型的建立及血清HBV标志物的检测:小鼠予流体动力法注射pAAV/HBV1.2-GFP或磷酸盐缓冲液造模1d后，实验组10只小鼠血清HBsAg均阳性，小鼠HBV DNA载量平均为（5.02±0.87）×103拷贝/ml；造模30d后，仍可检测到HBsAg，且HBV载量仍高，平均为（4.48±0.63）×104拷贝/ml。在造模90d后，HBsAg阳性的小鼠HBV DNA载量平均为（4.82±0.55）×104拷贝/ml，且在这些小鼠血清中能检测到抗-HBc，但没有检测到抗-HBs。对照组在整个实验过程中均未检测到HBsAg和HBV DNA。

2. 肝组织学分析：血清HBsAg阳性小鼠肝脏结构正常且没有明显的炎症反应。造模90d后，HBsAg阳性的小鼠仍没有明显的炎症反应（图略），且小鼠血清ALT也处于正常水平，为（28.00±2.79）U/L。

3. PD-L1在慢性HBV感染小鼠肝组织中的表达：免疫组织化学分析结果显示，正常小鼠肝非实质细胞，包括肝窦内皮细胞和枯否细胞均弱表达PD-L1，实验组造模90d后，肝组织中PD-L1的表达明显强于对照组（图略）。

4. 阻断PD-1/PD-L1通路增强慢性HBV感染小鼠抗病毒免疫：注射抗PD-L1抗体的实验组共5只小鼠，给以抗PD-L1处理后14d，其中有2只肝组织中检测不到HBsAg和HBcAg，另3只小鼠肝组织HBsAg和HBcAg的表达明显减弱（图略）；而注射IgG2a或磷酸盐缓冲液的对照组肝组织HBsAg和HBcAg的表达没有明显变化（图略）。

实验组给予抗PD-L1处理后14d，血清ALT水平较干预前明显上升 (t＝5.463，P<0.01，图略)，同时血清HBV DNA载量显著下降（t＝4.919，P<0.01，图略）；而对照组血清ALT及HBV DNA水平均无明显变化（t值分别为2.164、1.997，P值均>0.05），见图略

讨    论

HBV的免疫清除依赖机体病毒特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应的激活，主要在肝脏通过非溶细胞及溶细胞途径清除HBV。慢性HBV感染者HBV特异性CTL功能低下，机体存在不同程度对HBV的免疫耐受和特异性免疫功能不全，患者血液中HBV特异性CD8+ T淋巴细胞应答水平很低或几乎检测不到，HBV很难被免疫清除[4]。目前认为，打破免疫耐受，提高特异性细胞免疫功能, 通过溶细胞及非溶细胞途径清除HBV，是慢性HBV感染的关键治疗措施[5]。

PD-1是相对分子质量为5.5×104的跨膜蛋白。PD-1分子表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和骨髓细胞[6]。PD-L1和PD-L2是它的两个配体，PD-L1组成性表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞，当这些细胞活化时表达进一步上调，PD-L1也表达于一些非淋巴样细胞如血管内皮细胞、胰腺β细胞、骨骼肌细胞等；PD-L2仅在树突状细胞和巨噬细胞诱导性表达[6]。PD-1与PD-L1或PD-L2的相互作用，可抑制T淋巴细胞增殖和细胞因子（IL-2、IFNγ及IL-10）的产生[7-8]。

Iwai等[9]发现小鼠肝脏的窦状上皮细胞和枯否细胞组成性表达PD-L1分子，在体外细胞培养中发现表达PD-L1的肝脏非实质细胞能有效抑制已激活T淋巴细胞的增殖，PD-L1单克隆抗体可逆转此抑制效应。进一步研究发现用腺病毒感染PD-1基因缺陷小鼠可诱导肝组织中效应T细胞的大量增殖，较野生型小鼠更快清除病毒。该研究揭示了PD-1/PD-L1通路在病毒感染后效应性T淋巴细胞免疫耐受中可能起重要作用。

Huang等[3]用流体动力法给正常C57BL/6小鼠尾静脉注射具有复制能力的1.2倍HBV DNA (pAAV/HBV1.2)，创建了慢性HBV感染的小鼠模型，该模型小鼠血清中可检测到高水平的HBV DNA且HBsAg持续存在超过6个月，该小鼠模型是研究慢性HBV感染免疫耐受机制及新治疗方法一个较好的工具。

我们复制了Huang等[3]的慢性HBV感染的小鼠模型，建模第1、30、90天，血清HBsAg阳性的小鼠可检测到高载量HBV DNA，均没有检测到抗-HBs；血清ALT也处于正常水平；免疫组织化学分析结果显示肝脏结构正常且没有明显的炎症反应，与Huang等的报道相符。此外，慢性HBV感染小鼠肝非实质细胞（包括肝窦内皮细胞和枯否氏细胞）高表达PD-L1蛋白，与Iwai等[9]的研究结果相似。

Boni等[10]证实，在慢性乙型肝炎患者中，T淋巴细胞应答水平与血清病毒水平呈负相关。病毒特异性T淋巴细胞主要在较低病毒水平患者中检测到，这些HBV特异性CD8+ T淋巴细胞表达PD-1，当用PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1通路后可提高它们的活性。本研究结果显示：阻断慢性HBV感染的小鼠体内PD-1/PD-L1信号通路后，小鼠血清ALT水平明显上升，与此同时，血清HBV DNA载量显著下降。提示封闭抑制性的PD-1/PD-L1信号途径后，慢性HBV感染小鼠的免疫耐受状态被打破，机体免疫系统开始清除HBV，肝脏出现炎症反应，血清ALT升高，体内HBV DNA水平下降。

PD-1/PD-L1在免疫耐受中有着双重作用：切断自身反应性T淋巴细胞诱导外周耐受，抑制效应性T淋巴细胞维持耐受。在肝内慢性病毒感染时，PD-1抑制通路的上调可介导活化T淋巴细胞功能失活并促进其凋亡，可以成为某些个体不能产生有效的T淋巴细胞应答来清除病毒的原因之一。封闭抑制性信号通路PD-1/PD-L1可有效恢复抗原特异性CTL的功能，有效清除慢性病毒感染，这一策略给慢性乙型肝炎的治疗带来了新希望，但要真正用于临床还有很长的路要走，许多问题，如PD-1/PD-L1信号要阻断到什么程度、多长时间、干预的最佳时机和方式，如何最大程度减少免疫病理损伤和自身免疫性疾病的发生等有待于进一步研究。

参  考  文  献

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[2]Chen CJ, Yang HI, Su J, et al. Elevated serum level of hepatitis B virus DNA is an independent risk factor for hepatocellular carcinoma: A long-term follow-up study in Taiwan. J Hepatol, 2005, 42 suppl 2: 16-17.

[3]Huang LR, Wu HL, Chen PJ, et al. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103: 17862-17867.

[4]Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nat Rev Immunol, 2005, 5: 215-229.

[5]Si CW. Status quo associatied with chronic hepatitis B. Linchuang Yaowu Zhiliao Zazhi, 2006, 4: 1-2. (in Chinese)

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[8]Latchman Y, Wood CR, Chernova T, et al. PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat Immunol, 2001, 2: 261-268.

[9]Iwai Y, Terawaki S, Ikegawa M, et al. PD-1 inhibits antiviral immunity at the effector phase in the liver.  J Exp Med, 2003, 198: 39-50.

[10]Boni C, Fisicaro P, Valdatta C, et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. J Virol, 2007, 81: 4215-4225.

(收稿日期：2009-12-03)

（本文编辑：金生）

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