裸露DNA经胆道分支导入活体肝脏的局部表达

【摘要】  目的  经胆道分支逆行导入裸露DNA，观察目的基因在正常及急性损害大鼠局部肝脏的定量和定位表达。 方法  运用D-氨基半乳糖制作大鼠急性肝损害模型；经胆管分支将Cy3荧光标记CMVβ质粒通过胆道分支逆行导入局部肝脏，观察裸露DNA导入肝脏的情况。同时运用包含萤火虫荧光素基因质粒pGL3及包含大肠埃希氏菌β半乳糖苷酶基因质粒pCMVβ逆行导入大鼠局部肝脏，定量检测荧光素酶和定位检测β半乳糖苷酶在肝脏的表达。应用非参数Kruskal-Wallis 法秩和检验进行统计分析。 结果  肝组织冰冻切片观察到Cy3荧光标记DNA在汇管区附近聚集。按100μg/ml浓度进行基因导入，荧光素酶基因在正常大鼠肝脏，急性损害大鼠肝脏均有显著表达。大肠埃希氏菌β半乳糖苷酶定位检测结果显示正常大鼠肝脏及急性肝损害大鼠肝脏内有β半乳糖苷酶显著表达，并可见较多肝细胞表达β半乳糖苷酶。 结论  裸露DNA经胆道逆行导入正常及急性损害肝脏局部能获得较好表达，且无明显加重肝脏损害，该项方法为肝脏基因治疗的实验研究提供了良好的技术平台。

【关键词】  基因疗法； 模型，动物； DNA, 裸露;  肝损害

Study on gene delivery via the bile duct to rat liver using naked DNA particles    HU Jin-hua,  XU Biao,  CHEN Jing,  HE Wei-ping, WANG Ye-dong,  WANG Hui-fen. Liver Failure Treatment and Research Center, 302 hospital of the PLA, Beijing 100039, China

Email: hjh@medmail.com.cn

【Abstract】    Objective    To evaluate the efficacy of gene delivery to the right lateral lobe of the rat liver via a branch of the bile duct using naked DNA. Methods    We evaluated regional gene delivery to the right lateral lobe of the rat liver via a branch of the bile duct, using naked DNA, including pGL3, pCMVβ and Cy3 labeled CMVβ. Results    Gene expression was observed in right lateral lobe of both the damaged and the normal rats liver. The gene delivery efficiency was similar in two groups (P > 0.05). Gene expression was found in the right lateral lobe of damaged and normal livers. Fluorescence was observed in the region of the portal triads, and occasionally, in the lobule. Conclusion    Retrograde infusion of naked DNA via the bile duct is an effective way to deliver genes to in both damaged and normal rat liver.

【Key words】     Gene therapy;    Model, animal;    DNA, Naked;    Liver injury

近期，我们运用非病毒载体pGL3携带报告基因经胆道分支导入大鼠局部肝脏，在急性肝损害的大鼠肝脏内成功获得表达[1]。但基因表达量仍较低，而正常大鼠肝脏几乎无表达。裸露DNA作为非病毒载体DNA的一种分子量小，制作方法简单、标准，吸引了众多的研究者开始运用裸露DNA直接导入靶器官、细胞进行表达观察的实验[2-3]。目前已有裸露DNA通过肝动脉、尾静脉高动力注射方法研究大鼠肝脏基因表达的相关报道，也有裸露DNA瘤体内注射表达的研究报道[4-6]。本实验应用裸露的报告基因DNA直接经胆道分支导入正常及急性肝损害模型的局部大鼠肝脏（第2、3叶）内，通过定位、定量观察和比较基因在大鼠肝脏的表达情况，大鼠存活及肝脏病理损害情况，简化基因导入技术并观察其可行性，从而进一步证实经胆道分支向肝脏导入基因并表达实验平台技术稳定性，并为肝脏基因治疗的临床研究探索可行的技术路径。

材料与方法

1．实验动物：LEW大鼠，雌性，体质量180～240g，8～14周龄，购于北京维通利华公司。随机分为2组，即正常组、急性肝损害模型第7天组，每组11只。

2．急性肝损害动物模型的建立：肝损害组大鼠接受D-氨基半乳糖（D-galactosamine）腹腔注射，按体质量0.7g/kg给药，造模备用。D-氨基半乳糖购自美国Sigma-Aldrich公司。

3．经胆道基因导入实验手术、荧光基因表达量检测及β半乳糖苷酶肝组织表达定位检测方法同文献[1]。裸露DNA溶液浓度为100μg/ml，以体质量0.1ml/kg标准量进行右胆管分支注入大鼠肝脏第2、3叶。正常大鼠、急性肝损害模型大鼠各5只接受荧光报告基因pGL3质粒导入。正常大鼠、急性肝损害模型大鼠各3只接受pCMVβ基因质粒胆道导入。报告基因pGL3质粒：包含萤火虫荧光素基因和猴病毒40（SV40）启动子、报告基因pCMVβ质粒、包含大肠埃希氏菌β半乳糖苷酶和巨细胞病毒（CMV）启动子、pGL3质粒和pCMVβ质粒均由英国伦敦大学国王医学院肝病与肝移植中心临床科学实验室Dong Xuebin华人学者赠送。

4．荧光标记测定：正常及肝损害模型大鼠各3只，经Cy3荧光标记（2μg/ml）的CMVβ质粒溶液，浓度为100μg/ml, 经胆道分支逆行导入肝脏。胆道结扎2h后，处死大鼠，取肝脏第1、2叶组织约0.5cm×0.5cm×0.5cm，立即液氮冷冻，-80℃保存。肝组织冰冻切片6～8mm，空气中干燥1h， 滴上一滴包含4,6-二氨基-2-苯基吲哚的Vectashield（购自美国Vector Laboratories公司）封片。荧光显微镜下观察结果。Cy3标记细胞内核酸示踪试剂盒 (Cy3label IT tracker intracellular nucleic acid localisation kit，购自英国Cambridge BioScience公司)。荧光显微镜购自日本Olympus公司。

5．统计学方法：采用非参数Kruskal-Wallis 法秩和检验进行统计分析。

结    果

1. 荧光素酶基因在肝脏局部的定量表达：全部正常及肝损害大鼠肝脏第2、3叶直接接受裸露DNA经胆道逆行注入。定量分析结果显示均有荧光素酶活性表达，两组间差异无统计学意义（P>0.05），见图略。正常及急性损害大鼠肝脏第1叶均未直接接受基因导入，作为对照，检测到非常低活性的荧光素酶活性表达，与实验组间差异有统计学意义（H＝9.5，P<0.01）。

实验组为正常及肝损害模型第7天组大鼠（各5只）肝脏第2叶，接受裸DNA（pGL3 ）质粒导入，每只大鼠肝脏第2叶内荧光素酶表达水平（每毫克蛋白相对应的相对光子数）较对照显著升高（平均秩差分别为7、8，P<0.01)，两组间差异无统计学意义(平均秩差为1、P>0.05)。对照为正常大鼠肝脏第1叶未直接接受裸DNA（pGL3）质粒导入，荧光素酶几乎不表达。

2. 正常大鼠、急性肝损害大鼠肝脏第2、3叶肝组织汇管区附近可见、肝小叶内偶见红色荧光聚集（图略），对照肝脏第1叶阴性。

3. β半乳糖苷酶基因在肝脏局部的定位表达：正常大鼠、急性肝损害模型第7天大鼠分别接受pCMVβ裸露DNA经胆道分支导入，X-gal染色显示，正常大鼠肝脏、急性肝损害大鼠肝脏第1叶均未检测到β半乳糖苷酶显著表达,而正常及急性肝损害大鼠第2叶肝脏组织内显示点、片状β半乳糖苷酶表达,可观察到较多肝细胞内表达β半乳糖苷酶（图略）。组织图片显示，β半乳糖苷酶在正常大鼠肝组织中以肝细胞表达为主，局部表达量较大；而肝损害模型大鼠的肝组织中表达的部位更加广泛，除肝细胞外，窦细胞也有明显表达。由于实验动物数有限，表达是否有存在上述特点尚不能明确。

4．HE染色显示无论是正常肝脏及急性损害大鼠肝脏，基因导入前后肝脏组织结构无显著变化。

讨    论

早在20世纪90年代，应用病毒载体携带基因经胆道逆行导入肝脏研究基因在肝脏表达就有了多篇报道，但普遍认为表达效率不如静脉注射理想[7-9]，而且由于病毒载体显著的机体毒性问题，使得这一基因导入技术研究停滞不前。近年来，John Fabre研究小组运用氯喹预先致大鼠肝脏损害，然后将Polylysine-molossin与DNA组成复合物经胆道分支导入大鼠局部肝脏，急性肝损害的大鼠肝组织中获得了较好的表达[10-12]。有学者运用胆道注射技术先后探索了壳聚糖DNA、聚乙二醇壳聚糖DNA复合物、聚乙二醇与可降解阴离子多聚氨基磷酸酯组成的共聚体微粒DNA的大鼠活体肝脏基因表达情况，获得了较好的效果[13-15]。 Tominaga等[16]用腺病毒载体携带基因经胆道导入大鼠肝脏也获得较稳定的表达。但肝组织表达量需要达到治疗水平，表达载体仍然值得研究和拓展，我们将裸露DNA直接经胆道导入大鼠肝脏，荧光素酶报告基因定量检测和β半乳糖苷酶定位检测显示，不论是正常还是急性损害的大鼠肝脏内，都有较好的表达，两组差异无统计学意义。之前我们运用非病毒载体基因经胆道导入大鼠肝脏，在急性肝损害大鼠肝脏中得到了较显著表达，但正常大鼠肝脏表达很低[1]。有理由认为裸露DNA分子量明显小于非病毒载体DNA，有利于穿透微细胆管上皮的紧密连接，因此，在正常肝脏也能获得较好表达。基因表达量的对比分析结果提示，无论是非病毒载体DNA，还是裸露DNA经胆道导入大鼠肝脏的表达量仍然处在同一水平。但从技术角度来看，裸露DNA制备简单，实验控制条件的要求较低，因此，裸DNA经胆道导入肝脏并实现在肝组织表达在方法上较非病毒载体DNA经胆道分支导入更加简便易行，值得进一步研究和发展。

本次实验中，我们应用Cy3荧光标记CMVβ质粒，经胆道导入大鼠肝脏，手术后2h肝组织冰冻切片显示DNA已进入肝组织内，尤其在汇管区附近明显，充分证实了经胆道基因导入肝脏技术方法的可靠性。

手术前后对照研究结果显示，不论是正常还是急性肝损害的大鼠肝组织学检测结果无明显差别。该裸露DNA经胆道逆行导入肝脏具有良好的安全性。提示裸露DNA胆道逆行基因导入局部肝脏是研究肝脏疾病基因治疗的一条切实可行之路。而且临床广泛开展的腹腔镜，经皮胆管穿刺技术为这一路径提供了潜在、广阔的临床应用前景。

志谢  感谢英国伦敦大学国王学院肝病及移植中心临床科学实验室Dong Xuebin华人学者为本实验提供了技术支持

参  考  文  献

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（收稿日期：2009-12-11）

（本文编辑：金生）

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