胞内氯离子通道蛋白1基因沉默对小鼠肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响

【摘要】  目的  合成和筛选有效抑制细胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）基因的shRNA序列，构建表达质粒，并进一步研究CLIC1基因的表达被抑制后小鼠肝癌细胞株Hca-F细胞增殖及侵袭能力的变化。 方法  设计并合成3条理论上最佳的siRNA序列，进而将相应的双链DNA插入pGPU6/GFP/Neo质粒中，以脂质体Lipofectamine 2000将DNA质粒稳定转染至小鼠Hca-F细胞中，收取细胞进行逆转录多聚酶链反应分析各组的CLIC1 mRNA表达水平，选出最佳干扰序列。应用细胞计数试剂盒检测最佳干扰序列表达质粒稳定转染的Hca-F细胞，对比观察其干扰前后增殖情况的变化；应用transwell小室检测其侵袭能力的变化。对研究数据应用统计学软件SPSS13.0进行方差分析。 结果  靶向CLIC1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体经测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致。经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。稳定转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3表达质粒的Hca-F细胞对其CLIC1 mRNA抑制效果明显，抑制率达42.4%。经该表达质粒的干扰后，Hca-F细胞的增殖能力明显增强，侵袭能力显著下降，空白对照组、无关序列处理组、shRNA干扰组的穿膜细胞个数分别为98.93±5.00、96.27±2.60、50.73±3.89，P值均<0.01。 结论  pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3表达质粒能高效地抑制小鼠Hca-F细胞中CLIC1 mRNA的表达，CLIC1基因具有抑制小鼠肝癌细胞的增殖和促进其侵袭的作用。

【关键词】  癌，肝细胞； 增殖； 侵袭； RNA干扰； 氯化物通道

Effects of silencing chloride intracellular channel 1 gene expression on the proliferation and invasion of mouse hepatocellular carcinoma cell lines    LI Rong-kuan*, TANG Jian-wu, ZHANG Jun, WANG Shao-qing, WANG Mei, WANG Bo, ZHANG Yu-hong. *Department of Gastroenterology and Hepatology, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116023, China. 

Corresponding author: TANG Jian-wu, Email: jianwutang @163.com

【Abstract】    Objective    To study the effects of silencing CLIC1 gene expression on the proliferation and invasion of Hca-F cells. Methods    The mouse CLIC1 cDNA sequence was retrieved from NCBI. Three shRNA sequences were designed and cloned into pGPU6/GFP/Neo plasmids. The plasmids were transfected into Hca-F cells with Lipofectamine 2000. Cell Counting-8 (CCK-8) kit and transwell chamber were used to study the effects of CLIC1 on the proliferation and invasion of Hca-F cells. Results    The pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3 plasmid effectively repressed the expression of CLIC1 mRNA. Inhibition of CLIC1 gene expression led to decreased cell proliferation and reduced invasion. Conclusion    CLIC1 is essential for the proliferation and invasion of Hca-F cells.

【Key words】     Carcinoma, hepatocellular;    Proliferation;    Invasion;    RNA interference;    Chloride channels

氯离子通道蛋白1（chloride intracellular channel 1，CLIC1）是CLIC家族中的一员，又称NCC27，在机体内的分布存在组织及细胞特异性，提示了其可能在不同类型的细胞中具有不同的作用[1]。有研究结果显示，CLIC1参与细胞周期的调节以及细胞的增殖和分化过程[2-3]。对其在肿瘤方面的研究中，有学者发现其在肝细胞癌和乳腺癌中明显过表达[4]。近年来，有研究者应用蛋白质组学技术对临床患者的胃癌组织及邻近正常组织进行对比研究，发现胃癌组织CLIC1的表达上调67.9%，并且与淋巴结转移、淋巴管侵袭、周围神经侵袭、病理分期以及5年生存率显著相关[5]。另外，有学者应用相同方法对人大肠癌进行研究，发现CLIC1在大肠癌组织中表达上调了1.98～3.04倍[6]。因此，进一步研究该基因在肿瘤细胞中的确切作用对于寻找在肿瘤发生、发展机制中起关键作用的基因有重要意义。

材料与方法

1. 细胞和试剂：真核表达载体pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛公司；E.coli JM109购自上海吉玛公司；质粒抽提试剂盒购自美国Qiagen公司；RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购自北京同仁化学研究所；Transwell细胞板购自美国Coring公司；TRIzol试剂、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；限制性内切酶BamHⅠ、BbsⅠ、T4连接酶以及Taq酶购自TaKaRa生物工程有限公司；DNA2000相对分子质量标准品购自美国Promega公司；lamda/Eco130I相对分子质量标准品购自TaKaRa生物工程有限公司；RPMI 1640购自美国Gibco公司；小牛血清购自美国HyClone公司；细胞外基质胶（ECM）、纤维黏连蛋白（fibronectin, FN）购自美国Sigma公司；小鼠肝癌Hca-F细胞株由大连医科大学病理教研室提供。

2．目的基因RNAi靶点设计：在GenBank中找到小鼠CLIC1的基因序列，序列号为NM_033444(ID: 118130828)，应用Whitehead研究所的siRNA设计软件，通过计算机网络(网站为http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA)辅助设计siRNA，结合RNAi效率预测公式进行评估，包括分析自由能特性，与mRNA的空间可接触性，排除偏靶（off-target）效应等，最终筛选出3条理论上最佳的siRNA序列，分别命名为CLIC1-A、CLIC1-B和CLIC1-C，同时设无关序列阴性对照和阳性对照（GAPDH）：CLIC1-A：5′-CTTCTCCCAGAGACTGTTCAT-3′，3′-GAAGAGGGTCTCTGACAAGTA-5′；CLIC1-B：5′-CACCAACAAGATCGAGGAATT-3′，3′-GTGGTTGTTCTAGCTCCTTAA-5′；CLIC1-C：5′-GAAGAGATAGAGCTAGCCTAT-3′，3′-CTTCTCTATCTCGATCGGATA-5′。

3. shRNA的合成：shRNA模板中的袢结构选用TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′端添加了CACC，与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补；反义链模板的5′端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的黏端互补；如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。正义链和反义链由上海吉玛生物公司合成。

CLIC1-1引物正义序列为5′-CACCGCTTCTC CCAGAGACTGTTCATTTCAAGAGAATGAACA GTCTCTGGGAGAAGTTTTTTG-3′，反义为5′-GATCCAAAAAACTTCTCCCAGAGACTGTTCA TTCTCTTGAAATGAACAGTCTCTGGGAG AAGC-3′；CLIC1-2正义序列为5′-CACCGCAC CAACAAGATCGAGGAATTTCAAGAGAATTCC TCGATCTTGTTGGTGTTTTTTG-3′，反义为5′-GATCCAAAAAACACCAACAAGATCGAGGAA TTCTCTTGAAATTCCTCG ATCTTGTTGGTGC-3′；CLIC1-3正义序列为5′-CACCGAAGAGAT AGAGCTAGCCTATTTCAAGAGAATAGGCT AGCTCTATCTCTTCTTTTTTG-3′，反义为5′-GATCCAAAAAAGAAGAGATAGAGCTAGCCT ATTCTCTTGAAATAGGCTAGCTCTATCTC TTC-3′；阴性对照正义序列为5′-CACCGTTCTC CGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTG ACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′，反义为5′-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACG TAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3′；shhGAPDH正义序列为5′-CACCGTATGAC AACAGCCTCAAGTTCAAGAGACTTGAGGC TGTTGTCATACTTTTTTG-3′，反义为5′-GAT CCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAG TCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3′。

将DNA oligo分别用TE（pH8.0）溶解，浓度为100μmol/L。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置为50μl反应体系：10× shDNA Annealing 缓冲液5μl，正义链和反义链各5μl，双蒸水35μl。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃ 5min；85℃ 5min，75℃ 5min，70℃ 5min，4℃保存。退火处理后得到浓度为10μmol/L的shRNA模板。将所得模板溶液1∶500稀释，终浓度为20nmol/L，用于连接反应。

4. pGPU6/GFP/Neo载体的线性化：取2μg pGPU6/GFP/Neo载体，按照如下体系进行酶切处理：10×缓冲液G 5μl，BbsⅠ、BamHⅠ各2μl，pGPU6/GFP/Neo 2μg，加双蒸水至50μl。37℃酶切1h，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0（购自日本TaKaRa公司）回收，电泳检测并估算浓度，稀释浓度至50ng/μl。

5. pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体的构建：按照如下体系进行载体的连接反应（22℃，1h），转入大肠杆菌JM109感受态细胞内：10×T4 Ligation缓冲液2μl，pGPU6/GFP/Neo（BbsⅠ+BamHⅠ）、20nmol/L shRNA模板、T4 DNA连接酶各1μl，双蒸水15μl。

6. 重组质粒的转化、筛选和鉴定:每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50μg/ml Kanamycin的LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜。使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamHⅠ，PstⅠ分别酶切鉴定。每组选择两个克隆进行测序鉴定（由上海英骏生物技术有限公司进行）。

7. Hca-F细胞培养及转染: 将小鼠肝癌细胞Hca-F接种至225cm2培养瓶中，每瓶加入10ml RPMI 1640培养液（含10% 新生牛血清及100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、4mmol/L谷氨酰胺及lmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠)，置37℃、5%恒温CO2培养箱中，细胞为悬浮型，每2～3d传代，离心收集状态良好的细胞，用无血清RPMI 1640培养基重悬细胞，按照脂质体转染试剂盒Lipofectamine 2000操作说明转染细胞, 质粒和脂质体以1∶4配比，转染后的Hca-F细胞在含400μg/ml G418的完全培养基内培养筛选，15d后，85%～95%细胞死亡，余下的细胞继续用含400μg/ml G418的培养基培养，开始增殖并传代。

8. 半定量RT-PCR测不同pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达质粒对CLIC1的影响：细胞总RNA提取按TRIzol操作说明书进行，CLIC1 mRNA和GAPDH的引物用引物设计软件Oligo 6.0设计，其中GAPDH为内参照，引物由TaKaRa（大连）公司合成，分别为：CLIC1 F: 5′-ATGGCTGAAG AACAACCTCAGGT-3′，CLIC1 R: 5′-TCATTT GAGAGCCCTGGCCACT-3′，GAPDH F: 5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，GAPDH R: 5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。

根据RT-PCR试剂盒说明检测CLIC1，并摄影后应用计算机图像分析系统行灰度扫描，以与GAPDH的PCR产物DNA条带灰度值之比（CLIC1/GAPDH）作为反映CLLIC1 mRNA水平的相对指标来计算抑制率。抑制率的计算公式为：抑制率= (1-A1×B2/A2×B1)×100%。A1为转染干扰载体细胞的CLIC1 mRNA灰度值；A2为转染干扰载体细胞的GAPDH mRNA的灰度值；B1为未转染的Hca-F细胞的CLIC1 mRNA灰度值；B2为转染的Hca-F细胞的GAPDH mRNA灰度值。

9. CCK-8法检测pGPU6/GFP/Neo-shRNA稳转Hca-F细胞的增殖能力：将待检测细胞分为3组：未做处理的Hca-F细胞组（空白对照组）、转染无关序列的Hca-F细胞组（无关序列处理组）以及稳定转染pGPU6/GFP/Neo-CLIC1-3的Hca-F细胞组（shRNA干扰组）。取3组细胞离心，800r/min×5min，弃上清液。调整细胞浓度为1×104个/ml，按100μl/孔的量加入96孔板，每组细胞设5个复孔。将96孔板中的细胞在37℃，5% CO2的培养箱内培养，分别在24、48、72h后在每孔细胞悬液中加10μl CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育。加入CCK-8溶液1h后从培养箱中取出96孔板，用酶标仪在450nm处测各组样品的吸光度（A）值。

10. Transwell小室检测pGPU6/GFP/Neo-shRNA稳定转染Hca-F细胞的侵袭能力：无血清培养基重悬上述3组细胞，每组细胞设3个复孔，细胞计数后调整细胞浓度为3×105个/ml，至37℃ 5% CO2培养箱中饥饿培养24h。取出transwell小室，正反面分别在超净台紫外灯下照射3h，将小室放在对应的24孔板孔内，4℃过夜融化基质胶后，在每个Transwell小室中加30μl基质胶，轻轻晃动小室使ECM Gel均匀分布在小室上室面，放于超净台干燥过夜，在使用前加入10μl无血清RPMI 1640培养基均匀水化，在上室加入100μl饥饿培养的各组细胞，下室内加入含有10%新生牛血清、10μg/ml FN的培养基500μl，37℃、5% CO2培养箱中培养24h后取出transwell小室，用棉签仔细擦去上室面剩余培养基和未发生转移的细胞，室温干燥30min。待膜干燥后将小室浸在含有1%结晶紫溶液的24孔板中，染色20min，磷酸盐缓冲液洗膜数次，至洗去小室上多余结晶紫染色剂。每组细胞在镜下计细胞数。每个复孔取5个视野（左上、左下、右上、右下、中央）进行计数，并取平均数进行统计。

11. 统计学方法：部分数据用均数±标准差（x-±s）表示，所有数据应用统计学软件SPSS13.0进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. 质粒酶切鉴定：限制性内切酶PstⅠ酶和BamHⅠ双酶切质粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA，阳性重组载体可以被BamHⅠ切开，而不能被PstⅠ切开。然后各取4μl酶切产物在15g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳，结果见图1，2。

2. 重组质粒的DNA测序鉴定和细胞转染效率测定：重组质粒经自动基因测序仪测序（由上海英骏生物技术有限公司进行），结果与设计序列完全相符，所含目的基因序列准确无误，重组质粒构建成功。

3． 转染后各组细胞株中CLIC1 mRNA表达的检测：半定量RT-PCR检测各组细胞内CLIC1 mRNA水平，电泳结果及灰度扫描结果见图3，Hca-F、pGPU6/GFP/Neo-CLIC1-1、pGPU6/GFP/Neo-CLIC1-2、pGPU6/GFP/Neo-CLIC1-3、pGPU6/GFP/Neo-CLIC1-GAPDH、pGPU6/GFP/Neo-CLIC1阴性对照及其各对应的GAPDH的灰度值分别为6778.2对应3616.9、4669.7对应3818.3、3852.8对应3220.0、3485.5对应3237.9、3081.4对应1396.7、6970.2对应3815.4。计算结果显示pGPU6/GFP/Neo-CLIC1-3对CLIC1的抑制率最高，达42.4%。

4. CCK-8检测结果：各组细胞在培养24、48h和72h加入CCK-8溶液后应用酶标仪检测其在470nm处的A值，结果见表1。

表1  各组Hca-F细胞不同时间点的CCK-8检测结果

组别              各时间点A值

       24h  48h  72h

空白对照组    0.1848±0.0116     0.2270±0.0185     0.4348±0.0869

无关序列处理组    0.1862±0.0047     0.2250±0.0114     0.5110±0.0833

shRNA干扰组       0.2904±0.0209     0.3952±0.0364     0.7970±0.0804

  注：表中数据经重复测量的方差分析。无关序列处理组与阴性对照组之间的A值差异均无统计学意义，而shRNA干扰组分别与空白对照组以及无关序列处理组之间对比，其A值差异均有统计学意义，P值均<0.01

5. Transwell结果：各组细胞的穿膜细胞数见表2。

表2  三组细胞穿膜细胞数比较

组别                      穿过膜细胞个数   

       复孔1     复孔2     复孔3     x-±s

空白对照组    104.4      94.6 97.8 98.93±5.00

无关序列处理组    98.8 96.4 93.6 96.27±2.60

shRNA干扰组       55.0 49.8 47.4 50.73±3.89

  注：表中数据经单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，空白对照组和无关序列处理组穿膜细胞数比较，其差异无统计学意义，P＝0.440；而shRNA干扰组分别与空白对照组以及无关序列处理组比较，其穿膜细胞数的差异均有统计学意义，P值均<0.01

讨    论

我们在先前工作中应用Affymetrix公司的小鼠基因芯片Affymetrix GeneChipMOE430A检测Hca-F细胞的基因表达谱，发现CLIC1在Hca-F细胞中的mRNA表达显著上调[7]；另外，应用蛋白质组学技术进行分析，Hca-F细胞中CLIC1蛋白的表达水平亦明显升高[8]。随着越来越多的证据表明CLIC1在肿瘤的发生、发展中可能起重要作用，目前迫切需要一种方法进一步深入研究其功能。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术是近年来新兴的一种基因功能研究手段，并且可以作为新的基因治疗方法，临床应用前景广阔。这是一种广泛存在于生物界的自然现象，其最早是在秀丽线虫中被发现的，Fire等[9]在利用反义RNA进行线虫基因阻断时，发现双链RNA能够引起的mRNA降解，而且这一效应是基因特异性的。随后其机制被逐渐揭开：RNAi是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer酶加工成长度为21～23个核苷酸的RNA，然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）引导核酸酶降解靶mRNA，从而干扰相应基因表达。由于RNAi具有特异性高、基因抑制效率高、成功率高以及快速、经济的特点，具有非常好的应用前景。设计和筛选特异、高效的靶基因RNAi序列、通过有效方法把有效序列导入目的细胞是RNA干扰试验成功的关键[10]。我们通过计算机网络设计干扰序列，然后根据Tuschl算法的设计原则选取相应序列，排除偏靶效应，最终选出3条理论上最佳的序列，但有些序列效果较差，这可能与序列作用靶点有关[11]。有学者曾推测CLIC1可能对肿瘤细胞的增殖有抑制作用[12-13]。本实验中，我们应用RNAi技术将CLIC1基因的表达有效沉默，应用CCK-8试剂盒对其沉默前后的细胞增殖情况进行对比研究，结果表明沉默处理后的Hca-F细胞经过酶标仪检测，其A值明显增加，反映细胞的增殖情况明显增强，提示CLIC1基因具有抑制肿瘤细胞增殖的功能。另外，应用RNAi技术将CLIC1基因沉默后，经transwell小室检测Hca-F细胞的穿膜细胞数显著减少，反映其侵袭能力明显降低，提示CLIC1基因在肿瘤细胞的侵袭功能中起重要作用，能够提高肿瘤细胞的侵袭力。

Hca-F细胞是一种淋巴道转移能力极高（75%）的小鼠肝癌细胞株[8]，是研究肝癌淋巴道转移机制的理想模型。本实验中，我们成功地筛选出CLIC1基因的有效干扰序列并将其导入该细胞，对比观察CLIC1基因表达被抑制前后的增殖和侵袭情况的变化，明确了该基因在肿瘤细胞的增殖中所起的确切作用，为进一步研究CLIC1基因在肝癌的发生、发展过程中所起的作用奠定了基础。

参  考  文  献

[1]Ulmasov B, Bruno J, Woost PG, et al. Tissue and subcellular distribution of CLIC1. BMC Cell Biol, 2007, 8: 8.

[2]Sun HJ, Bahk YY, Choi YR, et al. A proteomic analysis during serial subculture and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cell. J Orthop Res, 2006, 24: 2059-2071.

[3]Rahman A, Kumar SG, Kim SW, et al. Proteomic analysis for inhibitory effect of chitosan oligosaccharides on 3T3-L1 adipocyte differentiation. Proteomics, 2008, 8: 569-581.

[4]Huang JS, Chao CC, Su TL, et al. Diverse cellular transformation capability of overexpressed genes in human hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 315: 950-958.

[5]Chen CD, Wang CS, Huang YH, et al. Overexpression of CLIC1 in human gastric carcinoma and its clinicopathological significance. Proteomics, 2007, 7: 155-167.

[6]Petrova DT, Asif AR, Armstrong VW, et al. Expression of chloride intracellular channel protein 1 (CLIC1) and tumor protein D52 (TPD52) as potential biomarkers for colorectal cancer. Clin Biochem, 2008, 41: 1224-1236.

[7]Song B, Tang JW, Wang B, et al. Identify lymphatic metastasis-associated genes in mouse hepatocarcinoma cell lines using gene chip. World J Gastroenterol, 2005, 11: 1463-1472.

[8]Liu S, Sun MZ, Tang JW, et al. High-performance liquid chromatography/nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry, two-dimensional difference in-gel electrophoresis and gene microarray identification of lymphatic metastasis-associated biomarkers. Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22: 3172-3178.

[9]Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, 391: 806-811. 

[10]Ohnishi Y, Tokunaga K, Hohjoh H. Influence of assembly of siRNA elements into RNA-induced silencing complex by fork-siRNA duplex carrying nucleotide mismatches at the 3'- or 5'-end of the sense-stranded siRNA element. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 329: 516-521.

[11]Hossbach M, Gruber J, Osborn M, et al. Gene silencing with siRNA duplexes composed of target-mRNA-complementary and partially palindromic or partially complementary single-stranded siRNAs. RNA Biol, 2006, 3: 82-89.

[12]Scheper MA, Shirtliff ME, Meiller TF, et al. Farnesol, a fungal quorum-sensing molecule triggers apoptosis in human oral squamous carcinoma cells. Neoplasia, 2008, 10: 954-963.

[13]Nawarak J, Huang-Liu R, Kao SH, et al. Proteomics analysis of A375 human malignant melanoma cells in response to arbutin treatment. Biochim Biophys Acta, 2009, 1794: 159-167.

(收稿日期：2009-11-08）

（本文编辑：金生）

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