内质网应激参与蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导大鼠脂肪性肝纤维化的发生与恢复

【摘要】  目的  探讨内质网应激在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用及饮食控制对脂肪性肝纤维化恢复的影响。 方法  蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCDD）喂养10周诱导非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠模型，恢复组于第9周开始将MCDD转变为蛋氨酸-胆碱对照饮食（MCCD）喂养2周。纤维化和炎症程度采用组织病理染色方法检测，纤维化和炎症相关因子采用Western blot和实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测，内质网应激标记物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）12、7和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）采用免疫组织化学、Western blot和RT-PCR方法检测。计量资料采用统计分析软件SPSS13.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析或q检验，并用LSD进行两两比较。 结果  饮食由MCDD转变为MCCD后，组织病理学结果显示肝细胞脂肪沉积及炎症反应明显减轻，伴随着活化的肝星状细胞和枯否细胞减少，肝纤维化程度明显减轻。模型组大鼠肝细胞凋亡数为每5个高倍视野（68.2±15.9）个，明显高于正常组（40.3±8.3）个，P<0.05；肝细胞增殖/凋亡比值（0.10±0.03）明显低于正常组（0.19±0.03），P<0.01。恢复组大鼠肝细胞凋亡数为每5个高倍视野（48.0±6.5）个，明显低于模型组（68.2±15.9）个，P<0.05；增殖数为每5个高倍视野（17.2±4.4）个，明显高于模型组（7.5±3.0）个，P<0.01；肝细胞增殖/凋亡比值（0.41±0.09）也明显高于模型组（0.10±0.03），P<0.01。模型组大鼠肝组织GRP78、caspase12、caspase7和cleaved caspase7蛋白质和mRNA表达均明显高于正常组（P<0.05或P<0.01），恢复组均明显低于模型组（P<0.05或P<0.01）。 结论  大鼠饮食由MCDD转变为MCCD后，肝脏的炎症和纤维化程度迅速逆转，提示饮食摄取对于控制肝脏脂肪沉积和病理改变至关重要，且内质网应激参与了这一过程，阻断内质网应激尤其是caspase12通路也许有助于非酒精性脂肪性肝纤维化的临床治疗。

【关键词】  肝硬化，非酒精性； 内质网； 枯否细胞； 肝星状细胞； 细胞凋亡

Involvement of endoplasmic reticulum stress in development of fatty liver fibrosis induced by methionine-choline-deficient diet in rats    MU Yong-ping*, Kwada Norifumi, Ogawa Tomohiro, XI Xiu-hong, CHEN Xiao-rong. *Shanghai Public Health Clinical Centre, Shanghai 201508, China

Email: ypmu8888@126.com

【Abstract】    Objective    To study role of endoplasmic reticulum stress in the development of fatty liver fibrosis induced by methionine-choline-deficient diet in rats. Methods    Non-alcoholic steatohepatitis was induced by 10 weeks- methionine-choline-deficient diet (MCDD), Markers of endoplasmic reticulum stress were determined by immunoblotting and real-time PCR. Results    The number of apoptotic hepatocytes, The expression levels of endoplasmic reticulum stress markers were increased significantly in MCDD group compared to control group (P < 0.05 or P < 0.01), while ratio of hepatocyte proliferation/apoptosis was decreased in MCDD group (P < 0.01). The number of hepatocytes apoptosis, and the expression levels of endoplasmic reticulum stress markers were decreased significantly 2 weeks after the feeding with normal diet in MCDD group (P <0.05 or P < 0.01), Conclusions    MCDD induces endoplasmic reticulum stress and fibrosis in rats.

【Key words】     Liver cirrhosis, nonalcoholic;    Endoplasmic reticulum;    Kupffer cells;    Hepatic stellate cells;    Apoptosis

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一个与肥胖和2型糖尿病密切相关的疾病，肝脏脂肪变性和肝纤维化密切相关[1]。NAFLD包含了从单纯的肝脏脂肪变性逐步发展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的病理过程，并进一步发展为肝硬化，且可能发展为肝癌。肝脏脂肪变性与肝纤维化发展之间的关系尚不明确[2]。尽管目前已经明确干扰素治疗可以逆转HCV感染引起的肝纤维化，但饮食控制能否使NASH后肝纤维化逆转尚不明确[3]。肥胖与细胞应激信号及炎症通路的活化有关[4]，其中内质网应激最终引起信号转导系统的激活，与人类阿尔茨海默病、帕金森氏病、糖尿病及各种肝脏疾病等密切相关[5-7]。本研究探讨了内质网应激在非酒性脂肪性肝纤维化发生与恢复中的作用。

材料与方法

1．材料：小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体购自美国Sigma公司，大鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）12单克隆抗体、山羊抗葡萄糖调节蛋白78（GRP-78）多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗caspase7多克隆抗体、兔抗Cleaved caspase7多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，小鼠抗CD68单克隆抗体购自丹麦Dako公司，小鼠抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体购自美国Chemicon公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗山羊多克隆免疫球蛋白、兔抗小鼠多克隆免疫球蛋白、兔抗大鼠多克隆免疫球蛋白和猪抗兔多克隆免疫球蛋白均购自丹麦Dako公司。

2．动物与模型制备：清洁级雄性Wistar大鼠（7～8周龄）购自日本SLC公司，恒温饲养，自由饮食。根据体质量将大鼠随机分为正常组、模型组和恢复组，每组5只。正常组大鼠予以蛋氨酸-胆碱对照饮食（methionine choline control diet，MCCD），模型对照组大鼠予以蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（methionine choline deficient diet，MCDD）喂养10周，恢复组予以MCDD喂养8周后，改为MCCD喂养2周。所有大鼠于第10周末乙醚麻醉下处死，下腔静脉采血，分离血清用于肝功能检测，肝脏采用磷酸盐缓冲液（PBS）灌流后摘取，用于组织病理、mRNA水平及蛋白质含量检测。

3．血清生物化学检测：下腔静脉采血，4℃ 3000r/min离心10min，血清ALT、AST、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）采用常规生物化学方法检测。

4. 组织病理和免疫组织化学分析：大鼠麻醉后，18G静脉留置针插入门静脉并固定，100 ml PBS灌流肝脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。组织切片厚5μm，采用苏木素-伊红（HE）、天狼星红和油红O染色。免疫组织化学染色参考文献[8]的方法，组织切片脱蜡至水，抗CD68（1∶100）、α-SMA（1∶100）和caspase12（1∶100）抗体孵育1h，HRP标记的第二抗体（1∶1000）孵育30min，洗涤，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染。油红O染色的阳性面积半定量分析采用Lumina Vision系统（购自日本Mitani公司）。

5．肝细胞原位凋亡检测：肝细胞原位凋亡检测采用原位末端标记（TUNEL）染色法，原位凋亡检测试剂盒购自日本TaKaRa Shuzo公司，按照试剂盒说明书方法操作，半定量分析方法参见文献[9]，即每组5张切片，每张切片任意选取5个不相重叠视野，400倍光镜下计数TUNEL阳性染色细胞总数。

6．肝细胞增殖分析：肝细胞增殖分析采用溴脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU）染色法，大鼠处死前2h腹腔注射BrdU 100g/kg，BrdU与细胞核结合的原位检测采用免疫组织化学方法。小鼠抗BrdU单克隆抗体（1∶1000）购自美国Sigma公司。BrdU染色阳性细胞半定量分析方法同TUNEL染色，即每组5张切片，每张切片任意选取5个不相重叠的视野，200倍光镜下计数BrdU阳性细胞总数。

7．实时定量聚合酶链反应：肿瘤坏死因子（TNF）α、α-SMA、转化生长因子（TGF）β1、Ⅰ型胶原蛋白A2（collagen 1A2，ColⅠA2）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP9、MMP13、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP1）、caspases-7、caspases-12和GRP78 mRNA表达采用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测，总RNA抽提采用Isogen试剂盒（购自日本Nippon Gene公司），方法参照文献[9]。mRNA表达检测参考文献[10]的方法，采用一步法TaqMan逆转录聚合酶链反应试剂盒（购自美国Applied公司），或一步法SYBR逆转录聚合酶链反应试剂盒（购自日本TaKaRa公司），以及应用生物系统PRISM 7700（购自美国Applied公司），引物及寡核苷酸探针序列见表1，由美国Sigma公司设计合成。每组5只大鼠均进行PCR的扩增，每个基因表达均采用GAPDH校正，探针一步法RT-PCR反应条件如下：48℃ 30min，95℃ 10min，95℃ 15s，共40个循环；60℃ 1min。SYBR一步法RT-PCR反应条件如下：42℃ 15min，95℃ 2min，95℃ 15s，共40个循环；60℃ 1min。

8．Western blot分析：Western blot方法参考文献[11]。肝组织采用RIPA缓冲液裂解，4℃ 12000r/min离心10min，Bio-Rad蛋白检测试剂盒（购自美国Hercules公司）测定上清液蛋白质浓度，10%或12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至Hybond-ECL硝酸纤维膜。5%脱脂奶粉TBS溶液封闭，第一抗体4℃孵育过夜，第二抗体室温下孵育1h，电化学发光法（试剂购自美国Pierce公司）显影，自动扫描仪读取每一条带的灰度积分值。第一抗体及稀释浓度如下：小鼠抗α-SMA单克隆抗体，1∶1000；大鼠抗caspase12单克隆抗体，1∶200；山羊抗GRP78多克隆抗体，1∶200；兔抗caspase7多克隆抗体，1∶1000；兔抗Cleaved caspase7多克隆抗体 (Asp198)，1∶1000；小鼠抗GAPDH单克隆抗体，1∶30000。

9．统计学处理：计量资料采用统计分析软件SPSS13.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析或q检验，并用LSD进行两两比较。

结    果

1．肝脏脂肪沉积变化：油红O染色结果显示，MCDD喂养10周后，模型组大鼠肝细胞脂肪大量沉积，恢复组大鼠肝脏脂肪沉积明显减少（图略）。油红O染色阳性面积百分比，正常组为0，模型组为9.45%，恢复组为3.27%，恢复组低于模型组（P< 0.01）。模型组大鼠血清FFA水平为（183.0±31.7）μEq/L，低于正常组的（274.0±35.7）μEq/L（P<0.01）；模型组血清TG水平为（43.3±12.1）mg/L，也明显低于正常组的（235.0±49.5）mg/L（P<0.01）。恢复组大鼠血清FFA和TG水平均较模型组明显升高，分别为（267.40±36.49）μEq/L和（282.0±49.7）mg/L，差异均有统计学意义（P值均<0.01）。    

2．肝脏组织学改变和枯否细胞活化：正常大鼠肝组织结构正常，模型组大鼠肝细胞呈空泡样变、点片状坏死和大量炎性细胞浸润，以上病理改变在恢复组明显改善（图略）。与肝组织病理改变相吻合，恢复组大鼠血清AST和ALT水平分别从模型组的（97.7±13.5）U/ml和（98.5±14.9）U/ml下降到（51.2±13.8）U/ml和（35.4±3.3）U/ml，差异均有统计学意义（P<0.01）。模型组大鼠枯否细胞活化标记物CD68较正常组明显增加，恢复组基本恢复正常水平（图略）。TNFα mRNA表达水平模型组（2.91±0.44）较正常组（1.18±0.87）明显升高（P<0.01），而恢复组（0.87±0.34）较模型组明显减少（P<0.01）。  

3．肝纤维化的消减与肝星状细胞活化：正常组大鼠肝组织仅汇管区及门脉周围有少量的胶原沉积，模型组大鼠肝组织胶原沉积明显增加，接近于肝硬化，恢复组大鼠肝组织胶原沉积明显减轻（图略）。免疫组织化学染色结果显示，模型组大鼠肝组织α-SMA表达显著增加，而恢复组明显减轻（图略）；Western blot和RT-PCR分析结果亦显示模型组大鼠α-SMA表达显著增加，恢复组明显降低至正常水平（图略）。模型组大鼠TGFβ1、ColⅠA2、MMP2、MMP9和TIMP1 mRNA表达较正常组明显增加（P<0.01），恢复组较模型组明显降低（P<0.05或P<0.01）；模型组大鼠肝组织MMP13 mRNA表达较正常组明显降低（相对表达量为0.98±0.30比3.39±1.24，P<0.01），而恢复组（相对表达量为2.30±1.11）较模型组明显增加（P<0.05），见图略。 

4．肝细胞凋亡和增殖改变：TUNEL染色结果显示，模型组大鼠每5个高倍视野肝细胞凋亡数为［（68.2±15.9）个］，较正常组［（40.3±8.3）个］明显增加（P<0.05），而恢复组［（48.0±6.5）个］较模型组明显减少（P<0.05），见图略。原位BrdU结合分析结果显示，尽管模型组大鼠增殖肝细胞数每5个高倍视野为（7.5±3.0）个，与正常组（7.6±1.0）个，比较无明显差异（P>0.05），但恢复组［（17.2±4.4）个］较模型组明显增加（P<0.01），见图略。肝细胞增殖（BrdU阳性细胞）/凋亡（TUNEL阳性细胞）比值，模型组（0.10±0.03）较正常组（0.19±0.03）明显降低（P<0.01），恢复组（0.41±0.09）明显增加（P<0.01）。

5． 内质网应激参与脂肪性肝纤维化的发生和修复：正常大鼠肝细胞仅有微量的caspase12蛋白表达，而模型组大鼠随着肝细胞的脂肪变性的加剧，肝细胞内caspase12表达明显增加，提示内质网应激发生于脂肪变的肝细胞内；而饮食结构改变后，恢复组大鼠肝细胞内caspase12表达明显减少（图略）。Western blot和RT-PCR结果显示，内质网应激标记物GRP78、caspase12、caspase7和cleaved caspase7蛋白及其mRNA表达在模型组明显增加（P<0.05），恢复组明显降低（P<0.05），见图11。

讨    论

本研究结果显示，MCDD诱导的脂肪性肝纤维化模型大鼠血清TG和FFA水平分别减少到正常大鼠的1/5和2/3，恢复组TG和FFA的分泌量显著增加。由于肝细胞脂肪变性减少了线粒体对FFA的摄入，FFA的溢出触发了β-氧化，导致活性氧自由基的合成并触发脂质过氧化反应，导致有毒物质的产生并损伤线粒体，进一步刺激活性氧的合成，这种正反馈循环引起了肝细胞损伤、肝脏枯否细胞活化和促炎症细胞因子的合成，进一步启动肝脏的炎症反应[12-14]。

枯否细胞是MCDD诱导肝损伤TNFα的主要来源。MMP9在肝脏也主要来源于枯否细胞，伴随着枯否细胞的活化，MMP9表达显著增加。病毒性肝损害患者血清及血浆的MMP9水平显著升高，且MMP9的突变能够抑制小鼠肝纤维化的形成[15]。随着枯否细胞的活化，模型组大鼠肝组织MMP9 mRNA表达显著增加，MCDD转变为MCCD后，MMP9表达显著下降，提示MMP9参与了MCDD诱导的脂肪性肝纤维化肝组织结构的重建。枯否细胞通过表达MMP13在肝纤维化的修复过程中扮演了重要角色[16]。本研究结果显示CD68阳性染色见于活化的枯否细胞，其数量在模型对照组明显增加，然而MMP13 mRNA表达却显著减少。当MCDD转换为MCCD后，伴随着MMP13 mRNA表达的增加，肝组织病理改变立即恢复，提示枯否细胞在脂肪性肝纤维化的修复过程中扮演了重要角色[17]。

星状细胞活化是非酒精性脂肪性肝纤维化发生的关键环节。损伤状态下，肝星状细胞活化或转分化为增生的成纤维细胞样细胞，产生大量的胶原纤维和TIMP1。TIMP1不仅抑制肝脏胶原酶的活性、促进细胞外基质的过度沉积，同时还可通过抑制肝星状细胞的凋亡促进胶原的合成。MMP2主要来源于活化的肝星状细胞，在肝纤维化早期参与基底膜的降解。本研究结果显示，随着ColⅠA2、TIMP1、MMP2和TGFβ1 mRNA表达的增加，肝脏胶原沉积和肝星状细胞活化的标记物（α-SMA）表达也显著增加。当MCDD转变为MCCD后，伴随着这些标记物的显著下降，肝脏胶原沉积显著减少，提示MCDD诱导的脂肪性肝纤维化与肝星状细胞的活化密切相关。

内质网应激参与非酒精性脂肪性肝纤维化的发生与修复。肥胖与肝脏和脂肪组织的内质网应激显著相关，内质网应激反应的起始调节者为蛋白激酶样内质网激酶和肌醇需求酶-1，未折叠蛋白在内质网腔内的聚集引起这些激酶低聚体依赖的自体磷酸化，称之为未折叠蛋白反应，因此启动了细胞质的信号转导[18]。内质网膜上活化的肌醇需求酶-1募集TNF受体关联因子2，并活化c-Jun N端激酶[19]。另外，生存反应激活内质网分子伴侣编码基因如葡萄糖调节蛋白78/Bip，它从三磷酸腺苷水解获得能量以防止内质网蛋白的聚合，被认为是经典的未折叠蛋白反应（内质网应激）活化的标记物[20]。本研究结果显示，GRP78（蛋白质和mRNA）和c-Jun mRNA在模型组显著增加，但当MCDD转变为MCCD后，它们均显著降低，提示内质网应激可能是MCDD诱导脂肪性肝纤维化形成的又一关键环节。

caspases也参与了内质网应激诱导的肝细胞凋亡。小鼠肝细胞胱天蛋白酶前酶（procaspase）12定位于内质网膜的细胞质面，被内质网应激特异活化而裂解[21]。caspase7在内质网应激状态下由细胞质转移到内质网膜的胞质面，与procaspase12结合并裂解procaspase12使其活化，活化的caspase12进一步裂解并活化procaspase9，依次活化下游包括caspase3在内的caspase级联，导致DNA裂解和细胞死亡[22]。本研究结果显示，caspase12、caspase7和cleaved caspase7的蛋白质、基因表达以及肝细胞凋亡数量在脂肪性肝纤维化时显著增加，而在饮食结构改变后显著降低。此外，尽管模型组肝细胞增殖无明显改变，但肝细胞增殖与凋亡的比值却显著降低，而在恢复组显著增加，提示肝细胞增殖与凋亡的失衡是MCDD诱导的脂肪性肝纤维化又一重要病理学特征。

尽管脂肪性肝纤维化的发病机制相当复杂，不仅包含了肝脏脂肪沉积、氧化应激、肝星状细胞及枯否细胞活化等已知因素，还可能与内质网应激和肝细胞增殖/凋亡的失衡密切相关，阻断内质网应激尤其是caspase12通路、抑制肝细胞凋亡和促进肝细胞再生也许对于非酒精性脂肪性肝纤维化的治疗具有潜在的临床价值。

参  考  文  献

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（收稿日期：2009-10-15）

（本文编辑：黄晨）

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