敲除Smad4基因对小鼠肝纤维化与肝癌发生和发展的影响

【关键词】  肝硬化； 癌，肝细胞； 小鼠； 转化生长因子β； Smad4基因

Effects of Smad4 on liver fibrosis and hepatocarcinogenesis in mice treated with CCl4/ethanol     XU Xin-bao*, HE Zhen-ping, LENG Xi-sheng, LIANG Zhi-qing, PENG Ji-run, ZHANG Hong-yi, ZHANG Hong-yi, XIAO Mei, ZHANG Hui, LIU Cheng-li, ZHANG Xi-dong. *Hepatobiliary Surgery Department, Airforce General Hospital of the PLA, Beijing 100142 , China

Email: xu_xinbao@sohu.com

【Abstract】    Objective    To study the effects of Smad4 on liver fibrosis and hepatocarcinogenesis in mice treated with CCl4/ethanol. Methods    The wild-type mice (Smad4 +/+) and the Smad4 knockout mice (Smad4 +/-) were injected subcutaneously with carbon tetrachloride(CCl4)/ethanol twice a week for twenty weeks. The expression of Smad4, TGFβ1, Smad2, Smad3, Smad6, TIMP1, MMP2 and MMP9 was detected by RT-PCR. Results    In the cirrhotic liver, the expression of Smad4 mRNA was significantly higher than that in the normal liver. Comparing with wild-type mice (Smad4 +/+), the TGFβ1-Smad4 signaling was markedly attenuated in the Smad4 knockout mice (Smad4 +/-). After induction by CCl4/ethanol, the hepatic fibrosis in the Smad4 knockout mice (Smad4 +/-) was obviously alleviated compared with the wild-type mice(Smad4 +/+), and the incidence rate of hepatocarcinogenesis of the former was also lower than that of the latter(32.0% vs 41.9%).  Conclusion    These results indicate that knocking out Smad4 can delay the progression of liver fibrosis and liver cancer.

【Key words】     Liver cirrhosis    Carcinoma, hepatocellular;    Mice;    Transforming growth factor beta;    Smad4 gene

转化生长因子β1 (TGFβ1) 是促进肝纤维化发生、发展的最主要因子[1]。但TGFβ1的信号传导需要Smads蛋白分子 (Smad2、Smad3和Smad4) 参与，其中Smad4是最关键和必不可少的蛋白分子[2]，Smad4是一种抑癌基因[3]。我们已经证实采用反义Smad4基因阻断TGFβ1的信号传导能够抑制肝脏储脂细胞产生胶原，减轻实验性肝纤维化的程度，并能减缓实验性肝癌的发生和发展[4-6]。为了更加深入观察Smad4与肝纤维化和肝癌的关系，我们采用CCl4/乙醇诱导Smad4基因敲除小鼠，使之产生肝纤维化和肝癌，并与野生型小鼠进行了比较。

材料与方法

一、材料

经美国国立卫生研究院终身教授邓初夏博士的许可，野生型小鼠（Smad4 +/+）73只与Smad4基因敲除小鼠（Smad4 +/-）62只（Black Swiss基因背景）由中国军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室杨晓研究员提供，体质量为20～24g，动物统一编号，统一饲养。本研究所采用的Smad4杂合子小鼠（Smad4 +/-）由美国国立卫生研究院的邓初夏博士主持所构建[7-8]。该小鼠所有的体细胞（包括生殖细胞）已经被施行了Smad4单基因敲除，因为敲除Smad4双等位基因的小鼠会在胚胎期7d左右死亡[7]。各基因引物序列及其扩增片段长度见表1，我们还针对Smad4基因设计了两对扩增不同长度片段的引物；3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为看家基因；引物由上海生物工程公司合成。所用PCR标志物购自中国华美生物工程公司，该标志物由6条长度分别为237、377、515、697、994、1543bp的片段组成。RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司。

二、方法

1. 动物分组及模型诱导：将实验动物分成2组：野生型对照组73只，其中雄性33只（正常对照组6只，诱导组27只），雌性40只（正常对照组7只，诱导组33只）；Smad4杂合子组62只，其中雄性26只（正常对照组3只，诱导组23只），雌性36只（正常对照组9只，诱导组27只）。动物模型的诱导按我们既往报道的方法并加以修改[9]；用CCl4/乙醇诱导小鼠肝纤维化模型，具体步骤如下：饮用8%乙醇水溶液，自由进食颗粒饲料，每周2次皮下注射25% CCl4橄榄油溶液5μl/g，持续20周。

2. 各组动物肝组织标本的处理：20周后处死各组动物，取肝脏记录大体情况，并取一般病理标本，均按常规固定、包埋。取余下的肝组织提取RNA。

3. Smad4及其他基因表达的检测：RT-PCR检测Smad4、TGFβ1、Smad2、Smad3、Smad6、TIMP1、基质金属蛋白酶（MMP）2、9等基因的mRNA表达程度。每次检测时确保各组动物的RNA上样量相等，并按照1∶3∶9的比例将每个待测RNA样品倍比稀释后检测，以确保结果可靠。

4. 常规HE染色进行病理检查：参照文献[5]划分肝组织纤维化程度和积分：“－”表示肝组织中无纤维组织增生，0分；“±”表示汇管区有少量纤维组织增生，仅局限于汇管区，0.5分；“＋”表示汇管区纤维组织增生向小叶内伸入，但尚未进入小叶1/2，1分；“++”表示纤维组织增生向小叶内进一步伸入，但尚未达中央静脉，2分；“+++”表示纤维组织增生向小叶内伸入达中央静脉，但尚未形成假小叶，3分；“++++”肝组织正常结构破坏，纤维组织弥漫性增生，分割形成假小叶，4分。

5. 统计学分析：采用SPSS11.5进行χ2检验及t检验。

结    果

1. 一般状况及大体观察：正常对照组小鼠一般状况良好，无死亡。硬化组小鼠一般状况较差，较瘦弱。野生型小鼠中，雄性死亡13只，雌性死亡16只；Smad4杂合子小鼠中，雄性死亡11只，雌性死亡14只；野生硬化组和Smad4杂合子硬化组的死亡数以及各组雄性、雌性的死亡数之间，差异均无统计学意义。死亡原因主要是肝坏死及由此引起的腹腔、肺部感染。野生组小鼠肝脏布满比较均匀的细颗粒，而Smad4杂合子组小鼠肝脏细颗粒较少且不均一。所有野生型和Smad4杂合子小鼠的胰腺、胃、肠道、肠系膜和脾脏均未发现肿瘤。两组肝细胞癌也未发现明显的肝外侵犯及转移。

2. 两组小鼠肝纤维化程度比较：Smad4杂合子小鼠肝脏与野生型小鼠肝脏比较，总体上野生型小鼠肝脏假小叶明显，纤维间隔较宽，而Smad4杂合子小鼠肝脏纤维间隔较细或者不明显，见图1～3。两组小鼠的肝纤维化程度见表2。

3. 肝癌发生情况比较：野生型小鼠和Smad4杂合子小鼠的正常对照组均无肝癌发生，两种小鼠硬化组肝癌的发生情况见表3。两组小鼠之间、雄性及雌性之间肝癌的发生率差异无统计学意义。肝包块均经病理证实为肝细胞癌。

4. Smad4杂合子小鼠纤维化肝脏表达、分泌Smad4的改变：RT-PCR显示野生硬化组小鼠肝脏Smad4 mRNA表达高于野生正常组，Smad4杂合子硬化组小鼠肝脏Smad4 mRNA的表达高于Smad4杂合子正常组，但低于野生硬化组小鼠。为了使实验结果更加可靠，我们设计了两对不同引物检测各组小鼠肝脏中Smad4 mRNA水平，结果非常一致。所以，总体上Smad4杂合子组小鼠肝脏Smad4 mRNA的表达低于野生对照组，如图4，5。

5. 其他指标：无论在正常的情况下或是在诱导肝纤维化的情况下，Smad4杂合子小鼠肝脏的Smad2和Smad3的mRNA表达均不同程度低于野生组小鼠（图略）。在诱导肝纤维化过程中，野生型和Smad4杂合子型小鼠肝脏的TGFβ1  mRNA表达均有所增强，前者增强稍明显一些（图略）。无论在正常的情况下或是在诱导肝纤维化的情况下，Smad4杂合子组小鼠肝脏MMP2、MMP9的表达均高于野生对照组（图略）；同样，Smad4杂合子小鼠肝脏的TIMP1的mRNA表达低于野生组小鼠（图略）；而Smad4杂合子小鼠肝脏的Smad6 mRNA表达高于野生组小鼠（图略）。 

讨    论

Smads是一类TGFβ的下游细胞内信号转导蛋白，包括8个成员，即Smad1～8。它们可分为三类：（1）受体激活Smads（receptor-activated smads，R-smads）；（2）共同伴侣Smads（common-partner Smads,Co-Smads）；（3）抑制性Smads（inhibitory smads，anti-Smads）。R-smads和Co-smads的氨基端与羧基端具有同源性，分别称为MH1和MH2区域，两者之间是一个含脯氨酸高的连接区。R-Smads包括Smad1，2，3，5和8。其中Smad1，5，8转导骨形态发生蛋白的信号，而Smad2，3转导TGFβ和激活素（activin）的信号。Co-Smads是Smad4，它是R-Smads转导信号的伴侣。R-Smads转导信号必须先与Smad4结合形成异源复合物，才能进到核中，调节转录活动。Anti-Smads包括Smad6和Smad7，可抑制R-Smads转导信号。提示在TGFβ的信号转导中，Smad4起关键作用。

TGFβ1在肝纤维化中起重要作用[1-2]。因此，抑制TGFβ1的活性，可以阻止肝纤维化的进程。纤维化肝脏内Smad2、Smad3、Smad4及TGFβ1的表达不同程度地高于正常肝脏[10-12]。有报道显示，TGFβ能够抑制人类免疫功能，促进肿瘤血管生成，改变局部微环境，直接促进人类多种恶性肿瘤的发生和发展；抑制TGFβ的信号传导，能够抑制人类多种肿瘤的生长[13]。本实验RT-PCR结果显示，通过敲除Smad4基因而阻滞TGFβ1信号传导后能上调Smad6的mRNA表达，下调肝脏TGFβ1、TIMP1的mRNA表达，上调MMP2、MMP9的表达，从而减少肝脏纤维组织生成。本实验结果显示，肝硬化组小鼠肝脏内的Smad4表达显著高于正常组，说明在肝硬化发展进程中，TGFβ-Smad4这一信号传导系统充分增强；Smad4单基因敲除(杂合子)小鼠肝脏的TGFβ1－Smads信号传导明显弱于野生型小鼠；经CCl4/乙醇诱导后，前者发生肝纤维化的程度显著低于后者；尽管统计学分析没有达到显著性差异，但前者的肝癌发生率也后者低近10%。

本实验结果进一步说明通过敲除Smad4基因可以显著降低Smad4的mRNA表达水平，阻滞TGFβ1信号传导，显著降低诱导小鼠的肝纤维化程度，同时，也能够不同程度降低实验性肝癌的发生率。该实验结果也表明，尽管目前Smad4基因尚不能被看作肝癌的抑制基因。由于其在TGFβ信号传导中发挥着关键性作用，因此，一旦通过抑制Smad4表达来阻断TGFβ1的信号传导，不但能减轻肝纤维化程度，也可能同时减少肝细胞癌的发生率。同时，在整个实验过程中，我们从没有发现Smad4基因敲除小鼠的胰腺、胃肠等腹腔内其他器官发生肿瘤，说明Smad4单基因敲除对其他肿瘤的发生影响不大，也显示采用下调Smad4基因表达的方式治疗肝纤维化并减少肝癌的发生是有效且相对安全的。

参  考  文  献

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（收稿日期：2009-07-24）

（本文编辑：袁平戈）

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