【关键词】 肝炎病毒，乙型； 共价闭合环状DNA； 松弛环状DNA Research advances on hepatitis B virus covalently closed circular DNA WANG Jie, WANG Mao-rong. 【Key words】 Hepatitis B virus; Covalently closed circular DNA; Relaxed circular DNA 【First author抯 address】 PLA Center of Liver Disease, No.81 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China Email: wangjiej@126.com 共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA，cccDNA）在HBV的复制及感染状态的建立过程中起着非常重要的作用，现将cccDNA的研究进展总结如下。 一、HBV cccDNA的检测方法 1. PCR法：PCR法包括普通PCR和定量PCR。由于松弛环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）在负链和正链上存在缺口，我们可以设计一对跨越两个缺口的引物，由于cccDNA有完整的双链，可以被有选择地扩增。但起始模板量不能太高，否则rcDNA也有可能被扩增，Ko..ck等[1]发现,每个PCR反应管中HBV DNA量在6×105拷贝/ml时能达到最佳的灵敏度与选择性。 He等[2]最早建立了实时荧光定量PCR，将具有发光基团和淬灭基团的TaqMan探针设计在负链缺口的下游，与负链互补。在上游引物的引导下，由于cccDNA负链是完整的，当子链延长到TaqMan探针结合位点时，聚合酶利用其5′→3′的外切酶活性将探针切断，解除3′端的淬灭基团对5′端的发光基团的抑制作用，产生荧光信号。由于rcDNA负链不完整，子链无法通过缺口到达探针结合位点，故不会产生荧光信号，从而将cccDNA与rcDNA区分开。该方法变普通PCR的终点监测为实时动态检测，不需要对PCR产物开盖检测，减少了PCR产物污染的可能性。Takkenberg等[3]改良了该方法，以提高其检测的灵敏度和特异性，主要做了两点改进：（1）PCR扩增条件的改良：50℃ 2 min，95℃ 10min；95℃ 10s，58℃ 5s，63℃ 10s，72℃ 20s，55个循环。既保证了复性时引物与模板的充分配对，又减少了非特异性产物的产生。（2）首次引入非竞争的DNA内参（internal control DNA，IC-DNA），当IC-DNA的荧光强度为阳性，cccDNA荧光强度为阴性时，cccDNA才是真正的阴性。设IC-DNA主要是为了监测DNA提取及PCR扩增的有效性。He等[2]对该方法的检测底线进行了测量，发现10拷贝/PCR时的阳性检出率为47%，从而推测出15拷贝/PCR的检出率约为50%，与相关报道的检测下限（25～100拷贝/PCR）比较，改良后的方法有更高的灵敏度，且线性与改良前的方法相似[4-5]。改良后的方法有更高的特异性，在扩增cccDNA时，不会与HBV rcDNA产生交叉反应。 2. 入侵检查：针对目标DNA设计两种探针，一种称为初始探针，另一种称为入侵探针，初始探针的5′端有1段寡核苷酸序列不与目标DNA互补，入侵探针的3′端的单个碱基不与目标DNA互补，flap核酸内切酶Ⅰ将初始探针5′端不与目标DNA互补的那段寡核苷酸序列剪切下来，此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭基团的荧光共振能量转移探针结合，从而产生荧光信号。Wong等[6]根据此原理，设计了与正链上游、负链下游HBV直接重复序列2区结合的入侵探针，由于cccDNA正链、负链均完整，故产生2种荧光信号，但rc DNA正链含有缺口，故只能产生1种荧光信号，可根据DNA产生的荧光信号区分cccDNA、rcDNA。 3. 滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）：phi29抗生素DNA聚合酶具有较好的3′→5′核酸外切酶（校正）活性，能够聚合超过7×104个核苷，而不与模板分离，从而置换出之前的延长链。更重要的是分枝扩增，因为置换链上暴露出更多的扩增引物的连接位点。与PCR比较，RCA表现出更少的扩增误差和更多的扩增产物，更长的产物和更高的保真度。得到全长HBV基因组后，用一步法PCR进行扩增，基于HBV rcDNA的负链上有一个短的富含A/T的终末端，可用于RCA产物单位长度HBV基因组的扩增。正向和反向引物设定在终末端中且部分重叠。两个引物中，LeuI（SapI）的识别位点非常接近重叠部分的序列，LguI从外侧切断酶切位点，从而在重叠序列中将PCR产物切割下来，释放出全长HBV基因组，并在没有任何核苷获得或丢失的情况下环化。由于RCA只能有效地扩增完全环化的DNA模板，虽然HBV rcDNA及其片段有完整的序列，但没有连接成环，故不能够被扩增[7]。在被HBV感染的细胞中，只有cccDNA能被RCA有效的扩增出来，并且不会整合HBV序列。RCA可以直接探测cccDNA池水平，对研究HBV基因组变化非常重要，特别是药物耐受突变的研究。与实时定量PCR比较，这种结合了RCA的PCR方法可将灵敏度提高10倍。这种联合法可以成功扩增出单用PCR法不能扩增出的乙型肝炎患者体内的病毒基因组。 4. 染色质免疫沉淀技术（chromatin Immunoprecipitation，ChIP）：通过与cccDNA特异结合的蛋白质，可以定量cccDNA并进行各种相关研究。ChIP基本原理是：在生理状态下通过甲醛将细胞内DNA-蛋白质交联在一起，与特异抗体结合的交联蛋白的免疫共沉淀反应中的DNA，被用作实时PCR的模板。以ChIP为基础的定量技术，不仅可以研究HBV微小染色体上的细胞蛋白质和病毒蛋白质的体内“招募”情况，还可研究有HBV复制的细胞中cccDNA功能表观遗传学的调控[8]。ChIP一般包括细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、交联反应的逆转、DNA的纯化和鉴定。由于ChIP涉及的步骤多，结果的重复性较低，故ChIP的每一步都应设计相应的对照，对结果的分析也需要经验。 二、HBV cccDNA检测的临床意义 1. 了解肝炎病毒颗粒的基础特性：Takkenberg等[3]发现部分病毒载量高于2×106拷贝/ml的患者血清中未检测出cccDNA，可能与引物和探针连接位点的突变导致cccDNA引物对HBV的连接能力受限有关。通过HBV全基因组的多重比对，发现HBV基因型对cccDNA的检测和定量的影响十分有限[8]。研究显示，在治疗前后，C型和B型患者在血清HBV DNA水平、肝内HBV DNA和cccDNA载量、生物化学指标及组织学指标差异无统计学意义，提示这两种基因型病毒对上述指标及抗病毒治疗的长期效果没有影响[2]。但由于标本量有限，此观点仍需进一步证实。 Takkenberg等[3]利用改良的实时荧光定量PCR法，证实了血浆中循环的cccDNA依赖于总HBV DNA水平，并与其成正相关。血浆中cccDNA的来源目前有两种解释：（1）部分cccDNA并没有到细胞核中重新集合，而是从肝实质细胞中直接释放到循环当中[6]；（2）cccDNA通过退化的肝实质细胞被释放到循环中。但cccDNA水平与ALT水平的相关系数相对较低[9]；提示肝细胞损伤并不是血浆中cccDNA的主要来源。该观点在Takkenberg等[3]的研究中得到进一步证实，重度慢性乙型肝炎患者的肝损比较严重，但某些慢性重度肝炎患者的血浆却未检测出cccDNA，说明损伤的肝细胞不是cccDNA的主要来源，也更有力地说明了cccDNA与总HBV DNA之间的密切关系，即与病毒复制密切相关。 2. 有助于临床合理用药：只有能够彻底清除HBV cccDNA的药物，才是真正“有效”的抗病毒药物。感染的肝细胞和cccDNA的半衰期都很长，抗病毒药物虽然能减少rc DNA，但对细胞内cccDNA几乎没有影响[10]。这在美洲旱獭模型中已经得到了证实，cccDNA的存在也许可以解释慢性乙型肝炎的复发[11]。Margeridon等[7]通过RCA联合PCR的方法，发现1例血清学已经转为抗-HBs阳性的患者在清除感染的HBV后，肝脏内仍有残存的cccDNA，证实了在维持基因稳定与再次复发之间的平衡时，cccDNA池有非常关键的作用，即使血清学已经转为抗-HBs阳性，耐药突变仍能够发生在cccDNA上，并一直存在下去。对这种迟发的突变，宿主的免疫应答能力很重要，一旦患者发生免疫妥协，就会面临复发的危险。研究表明，血清中cccDNA水平是体内HBV再激活的指标，也是肝脏损伤的早期信号[3]。 研究HBV变异，特别是耐药突变的出现以及检测cccDNA池的能力是非常重要的。rcDNA最初的突变发生在易出错的反转录过程中，并且这些rcDNA补充到cccDNA池时能够稳定地传播下来。这可能是通过两种途径完成的：（1）含有突变的rcDNA的核壳体能循环到细胞核中维持cccDNA池；（2）含有突变的rcDNA可能会隐蔽地感染新的肝细胞，rcDNA又转化成cccDNA。突变的rcDNA基因组在反转录时会与其他非突变的基因组、新突变的基因组发生竞争。因此，HBV变异的出现，包括药物耐药的突变，需要较长的过程，可能是几个月甚至是几年[6]。只要定时监测cccDNA池，就可以预测未来可能发生的问题。肝细胞中cccDNA的检测比检测血浆中cccDNA更有意义，但要从肝细胞中提取cccDNA，实验要求更高，难度也更大，需要更加特异、更加灵敏、重复性更好的检测方法。 三、展望 开展HBV cccDNA检测技术研究，深入了解cccDNA分子的结构与体内代谢过程，探讨cccDNA与病情转归、抗病毒疗效以及清除病毒效果的关系，对于确定抗病毒治疗的最佳治疗方案、时间和治疗终点等具有重要意义。 参 考 文 献 [1]K鯿k J, Theilmann L, Galle P, et al.Hepatitis B virus nucleic acids associated with human peripheral blood mononuclear cells do not originate from replicating virus. 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