【关键词】肝星状细胞； RNA聚合酶Ⅱ； 启动区（遗传学） Specific activities of SMP8 promotor in activating hepatic stellate cells CHANG Ying, JIANG Hua-jun, SUN Xue-mei, AI Li, CHEN Ting, YUAN Shun-yu, SONG Yu-hu, LIN Ju-sheng. 【Key words】Hepatic stellate cell; RNA polymerase II; Promoter regions (genetics) 【First author’s address】 Institute of Liver Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China Corresponding author: LIN Ju-sheng, Email: jslin@ tjh.tjmu.edu.cn Co-corresponding author: SONG Yu-hu, Email: yuhusong@ 163.com 我们已往的研究已经证实，RNA聚合酶Ⅲ启动子（polⅢ）载体表达的针对TGFβ1的核酶，在体外能有效逆转活化HSC的生物学活性[1]。但TGFβ1是广泛存在于各种细胞中，并发挥重要生物学效应的细胞因子，因此不具组织和细胞特异性的polⅢ启动子核酶表达系统，在抑制HSC活化的同时会影响到正常肝细胞或其他细胞的功能，这使得基因治疗肝纤维化变得困难。为达到靶向性治疗肝纤维化的目的，我们探讨了在活化HSC中特异性激活的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）启动子SMP8的生物学活性，研究其内含子1中CArG［CC（A/T）6GG］顺式作用元件对HSC中SMP8特异性启动子活性的影响，为下一步改造该启动子中的内含子1，使其作为靶向性基因治疗载体的启动子提供实验依据。 一、材料与方法 1. 主要材料：真核表达载体pSMP8由美国Cincinnati大学医学院James A.Fagin教授惠赠；真核表达载体pEGFP1、活化HSC株rHSC-99、胚胎肝细胞株L02均由华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所保存；活化型HSC-T6细胞由美国西奈山医学院Scott L. Friedman教授惠赠；肝癌细胞HepG2购自中国典型培养物宝藏中心；T4连接酶和高保真DNA聚合酶Pyrobest均购自日本TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；XhoⅠ和ApaⅠ内切酶均购自立陶宛MBI公司；Trizol购自美国Invitrogen公司。 2. pSMP8-EGFP真核表达载体和去内含子1的真核表达载体pmSMP8-EGFP的构建及鉴定：质粒构建示意图（图1）。用高保真DNA聚合酶从载体pSMP8上扩增α-SMA启动子片段SMP8，和除去内含子1的启动子片段mSMP8，操作按Pyrobest高保真酶的说明书进行，所用引物见表1。PCR条件：95℃变性3min；95℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 3.8min (SMP8)［90s(mSMP8)］, 30个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物行胶回收，回收产物和质粒pEGFP1用XhoⅠ和ApaⅠ双酶切，37℃过夜；次日行连接反应，将SMP8和mSMP8片段分别插入pEGFP1中。重组质粒行酶切和PCR鉴定，并送上海生工生物工程公司测序。 3. RT-PCR检测：HSC-T6、rHSC-99、L02和HepG2细胞常规培养。收集1×107细胞，加入1ml Trizol，按Trizol说明书的步骤提取总RNA。用DNA酶Ⅰ去除痕量DNA，操作步骤按照Invitrogen的产品说明书进行。根据GenBank的α-SMA序列设计引物，正义链：5′-TGTGCTGGACTCTG GAGATG-3′，反义链：5′-GATCACCTGCCCATCAGG-3′。PCR循环条件：94℃ 3min； 94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。产物进行20g/L的琼脂糖凝胶电泳。 4. 细胞培养与转染：HSC-T6、rHSC-99、L02和HepG2细胞用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液常规培养、消化传代。转染前一天，将处于对数生长期的HSC-T6、rHSC-99、L02和HepG2细胞按每孔2×104个接种在6孔培养板中。待细胞融合度为60%～70%时，用LipofectamineTM 2000将成功构建的pSMP8-EGFP和pmSMP8-EGFP真核表达质粒转染入细胞中，每孔质粒（μg）：LipofectamineTM 2000（μl）约为6∶8。转染后4h换上新鲜的完全培养液继续培养。 5. 荧光显微镜观察转染24h后细胞荧光表达情况并分析荧光强度。 二、结果 1. 重组质粒鉴定：从pSMP8载体上扩增的SMP8和mSMP8片段和原设计大小一致。采用XhoⅠ和ApaⅠ双酶切获得两个片段；采用ApaⅠ单酶切的重组质粒产生一个片段。酶切鉴定结果与预期结果完全一致。上海生工生物工程公司的测序结果和GenBank中的序列进行Blast比对，结果完全一致，证实重组质粒成功，将其命名为pSMP8-EGFP和pmSMP8-EGFP。 2. PCR结果：在HSC-T6和rHSC-99细胞内均检测到不同程度α-SMA mRNA的表达，且HSC-T6细胞中表达更明显；L02和HepG2细胞中未检测到α-SMA mRNA的表达（图2）。 3. 不同长度的SMP8启动子在两株活化HSC中的活性：用重组质粒pSMP8-EGFP和去内含子１的质粒pmSMP8-EGFP转染HSC-T6、rHSC-99、L02和HepG2细胞后检测荧光表达情况， HSC-T6和rHSC-99细胞内24h时可见荧光表达，48h达高峰，72h仍可见荧光。而在L02和HepG2细胞中未见有荧光表达。全长的SMP8启动子和去除内含子1的mSMP8启动子诱导的报告基因EGFP表达量没有明显的强度差异。EGFP的表达在HSC-T6细胞中强于rHSC-99细胞，这与两株细胞中α-SMA的表达差异水平一致。 三、讨论 本研究中，我们选用α-SMA启动子SMP8作为备选启动子。如图1所示SMP8启动子由三部分组成：α-SMA的启动子序列、5′非翻译区序列和内含子1序列。正常情况下，只有胚胎早期的心肌细胞和骨骼肌细胞可表达α-SMA，个体发育成熟后平滑肌细胞是惟一表达α-SMA的细胞[2]。有研究表明，SMP8中的内含子1中CArG［CC（A/T）6GG］顺式作用元件为平滑肌细胞表达α-SMA的必须调控元件，但胚胎早期心肌细胞和骨骼肌细胞表达α-SMA却不依赖于该元件[3]。HSC活化的特异性标志就是α-SMA的表达[4]。但SMP8启动子在活化HSC中的活性是否也受到CArG［CC（A/T）6GG］顺式作用元件的调控，目前鲜有报道。本研究中，我们首先验证了SMP8启动子在不同肝脏细胞株中的活性，结果显示不同活化程度的HSC细胞中有不同程度的α-SMA表达，而正常胚胎肝细胞L02和肝癌细胞HepG2中都没有α-SMA表达。这就证实了SMP8启动子在活化HSC细胞中的特异活性。 为探讨SMP8内含子1中的CArG［CC（A/T）6GG］顺式作用元件是否会影响启动子的活性，我们成功构建了pSMP8-EGFP和pmSMP8-EGFP重组载体。这两个载体的区别在于：pSMP8-EGFP载体应用了SMP8全长作为报告基因EGFP的启动子，而pmSMP8-EGFP载体采用的是去除了内含子1的SMP8启动子序列，也就等于去除了内含子1中CArG［CC（A/T）6GG］顺式作用元件。结果显示，无论启动子中有无CArG［CC（A/T）6GG］顺式作用元件，活化的HSC都可以表达报告基因EGFP。该结果表明，活化的HSC中SMP8的启动活性，不受内含子1中CArG［CC（A/T）6GG］顺式作用元件的调控。同时，我们还观察到：两种启动子诱导的报告基因EGFP的表达强度在同一种活化HSC中无明显差异；启动子在两株活化HSC细胞中诱导EGFP的表达强度与细胞中α-SMA的表达强度一致。该结果表明两种启动子诱导的报告基因表达的强度只受到HSC活化程度的调控，而不受CArG［CC（A/T）6GG］顺式作用元件的调控。 本研究证实了SMP8在活化HSC中的特异活性，以及其内含子1区域的可改造性，这就为我们下一步改造内含子1，即在其中插入shRNA序列，诱导针对靶基因的RNA干扰提供了优化的基因治疗载体。 参 考 文 献 [1]Song YH, Chen XL, Kong XJ, et al. Ribozymes against TGFbeta1 reverse character of activated hepatic stellate cells in vitro and inhibit liver fibrosis in rats. J Gene Med, 2005,7: 965-976. [2]Moll R, Holzhausen HJ, Mennel HD, et al. The cardiac isoform of alpha-actin in regenerating and atrophic skeletal muscle, myopathies and rhabdomyomatous tumors: an immunohistochemical study using monoclonal antibodies. Virchows Arch, 2006, 449: 175-191. [3]Mack CP, Owens GK. Regulation of smooth muscle alpha-actin expression in vivo is dependent on CArG elements within the 5' and first intron promoter regions. Circ Res, 1999, 84: 852-861. [4]Nouchi T, Tanaka Y, Tsukada T, et al. Appearance of alpha-smooth-muscle-actin-positive cells in hepatic fibrosis. Liver, 1991, 11: 100-105. 中华肝脏病杂志版权 |