【关键词】 肝硬化; 治疗； 干细胞； 脐血 Effects of the umbilical blood stem cell transplantation in patients with liver cirrhosis CHEN Hai-ou, HU Xiao-xuan, LIU Hong-juan, QIAN Lin. 【Key words】Liver cirrhosis; Therapy; Stem cell; Umbilical cord blood 【First author’s address】Hepatopathy Internal Department, Pepole’s Hospital of Hunan Province, Changsha 410006, China Corresponding author: HU Xiao-xuan, Email: hxx5527392@ sina.com 我科对失代偿期肝硬化患者进行脐血干细胞移植治疗，现报道如下。 一、资料与方法 1. 一般资料：本研究经有关主管部门批准，医院伦理委员会审核通过，并由患者签字同意。2008年12月-2009年8月期间收治的34例失代偿期肝硬化患者，男性27例，女性7例，年龄18～69岁，平均年龄49岁。22例为乙型肝炎后肝硬化、3例为乙型肝炎与酒精性混合性肝硬化、4例为酒精性肝硬化、4例为胆汁性肝硬化、1例为肝豆状核变性所致肝硬化。Child-Pugh分级：A级3例、B级21例、C级10例。术前均行腹部B超检查和（或）CT检查，25例并发腹水。实验室检查包括血清ALT、总胆红素（TBil）、白蛋白（Alb）、凝血酶原时间（PT），病例均行内科综合治疗。 2. 脐血采集: 选择健康产妇，排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒及其他传染性疾病，无病理妊娠。胎儿娩出并断脐后，用装有ACD-B保存液的一次性采血袋以封闭式采血法采血，每袋采脐血约100～140ml备用。 3. 脐血干细胞分离: 用负收集法分离提取脐带血干细胞，试剂盒由中国宁夏中联达生物有限公司提供。严格按照操作步骤进行，每例提取的脐带血干细胞总数为1.6×107～7.3×107，以等渗盐水稀释到5ml，即进行干细胞移植。 4. 移植方法：经股动脉穿刺插管，先行选择性肝固有动脉造影，排除肝癌后，将含有脐血干细胞的生理盐水经导管按脉冲式方法从肝固有动脉缓慢注入。 5. 疗效观察：术后住院期间及出院后的观察期所选择的病例均未使用保肝药物及输注人血白蛋白等,术后观察患者临床症状、体征和不良反应；术后1周、1、3、6个月复查肝功能、PT和腹部B超。 6. 统计学处理：数据以均数±标准差（x-±s）表示，比较采用配对t检验，所有数据采用SPSS13.0软件进行分析处理，P＜0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1. 脐血干细胞移植后患者身体状况的改善情况：移植后1周，34例患者食欲改善32例，体力好转29例，腹胀减轻28例。 2. 脐血干细胞移植后生化指标的改变情况: Alb术后1周有所下降，于术后1个月开始逐渐上升，术后6个月升高明显，但差异无统计学意义；ALT术后逐渐降低，但差异无统计学意义；TBil术后1周和1个月较术前有所上升，于术后3个月开始逐渐下降，术后6个月下降明显（P＝0.017），差异有统计学意义；PT术后均有不同程度改善，但与术前比较，差异无统计学意义，见表1。 表1 34例失代偿期肝硬化患者干细胞移植术前后 血液生物化学指标变化（x-±s） 时间 TBil(μmol/L) ALT(U/L) Alb(g/L) PT(s) 术前 47.3± 5.1 56.9± 6.7 30.9±0.6 17.9±0.7 术后1周 58.6±17.5 55.5± 7.2 30.3±0.7 18.9±0.8 术后1个月 64.2±18.2 55.2± 8.3 31.0±1.0 17.8±1.0 术后3个月 52.0±18.6 54.6± 9.6 32.3±1.1 16.7±1.1 术后6个月 24.6± 4.3 46.3±10.1 35.5±2.5 16.4±1.3 3. 脐血干细胞移植术后B超检查腹水情况：25例并发腹水患者,术后1周患者腹水减轻不明显；术后6月仅1例患者腹水增多，15例腹水明显减少，9例腹水消失。 4. 脐血干细胞移植后不良反应的发生情况：34例患者未见发热、白细胞下降、肝区疼痛等不良反应和并发症。 三、讨论 干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的不均一细胞群体, 其在一定的微环境下可以诱导分化为多种组织细胞, 具有很强的可塑性。现已证明干细胞在体内外均有极强的向肝系细胞分化的能力[1]。通过移植具有分化增殖能力的干细胞，使其在体内分化成肝细胞，可以代偿部分肝功能，从而干细胞移植在肝脏疾病中的应用倍受重视。展玉涛等[3]的研究结果显示在小鼠肝硬化模型中，移植的骨髓干细胞能分化成肝细胞并表达白蛋白和细胞角蛋白8，说明干细胞在肝硬化环境中能够增殖分化。 脐血中可移植干细胞比例明显高于成人骨髓及外周血[3]，且与骨髓干细胞相比脐血干细胞自我繁殖能力强、繁殖速度快。脐血干细胞可以分化为肝细胞[4]，动物实验将脐血干细胞输入急性肝损伤大鼠可在鼠肝脏内检测到人甲胎蛋白和Alb表达及检测到人的X染色体DNA[5]，说明脐血干细胞能在损伤的肝脏中增殖分化成为肝细胞。 我们发现：移植后患者ALT和TBil逐渐下降，Alb上升，PT改善，表明脐血干细胞移植治疗后，患者肝脏功能明显改善，这些变化特别是Alb的升高是一般护肝治疗不可能达到的。移植后ALT逐渐下降，但差异无统计学意义，考虑可能与肝硬化患者治疗前ALT升高不明显或在正常范围有关，加大样本量可能会有更好的比较价值。Alb在移植后1周时均有所下降，1个月后上升， 术后6个月升高明显，虽无统计学意义，但从临床的角度来说效果还是很明显的。TBil于移植后6个月时与术前比较，差异有统计学意义，表明脐血干细胞移植治疗能降低TBil水平。另外，我们还观察到移植后大多数患者的临床症状明显改善，腹水逐渐减少或消失，且34例移植患者中未发现严重不良反应及并发症。故我们认为脐血干细胞移植安全可行，可不同程度改善肝硬化患者临床症状及肝功能、凝血功能。 目前经肝动脉脐血干细胞移植仅是作为治疗肝硬化的一种新治疗方法加以探索，由于开展此项工作不久,病例数尚少，随访时间不长,虽然近期取得了一定效果,但其远期疗效如何尚需观察,对于脐血干细胞移植治疗肝硬化总的疗效评价还需大量的病例数和严格的对照研究。 参 考 文 献 [1]Sell S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells.Hepatology, 2001, 33: 738-750. [2] 展玉涛,魏来,陈红松,等.骨髓干细胞在大鼠肝纤维化形成环境中的分化.中华肝脏病杂志,2003,11:673-675. [3]Rocha V, Cornish J, Sievers EL, et al. Comparison of outcomes of unrelated bone morrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia. Blood, 2001, 97: 2962-2971. [4]Kakinuma S, Tanaka Y, Chinzei R, et al. Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells. Stem Cells, 2003, 21: 217-227. [5]Tang XP, Yang X, Zhang M, et al. Clinical and experimental study of the therapeutic effect of umbilical cord blood stem cell transplantation on liver failure and heart damage in severe viral hepatitis patients. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13:259-263.(in Chinese) 唐晓鹏，杨旭，张旻,等.脐血干细胞移植治疗肝功能衰竭及心肌损害的临床与实验研究.中华肝脏病杂志,2005,13:259-263. （收稿日期： （本文编辑：袁平戈）
热休克蛋白-2基因多态性与肝细胞癌的相关性 李文清 王承党 林经安 陈玉丽 吴婷 刘霞 陈瑞庆 【关键词】 热休克蛋白质类70； 癌，肝细胞； 基因多态性 Relationship of heat shock protein 70-2 gene polymorphism with hepatocellular carcinoma LI Wen-qing, WANG Cheng-dang, LIN Jing-an, CHEN Yu-li, WU Ting, LIU Xia, CHEN Rui-qing. 【Key words】Heat-shock proteins 70; Carcinoma, hepatocellular; Gene polymorphism 【First author’s address】Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China Email: Wenqingli@ 126.com 肝细胞癌（HCC）是我国的常见恶性消化道肿瘤之一，全球发病率逐年升高，其发生和发展与遗传、免疫和环境等因素相关。热休克蛋白（HSP）70是生物细胞受到高温、感染、炎症和缺血等应激刺激时产生的一组在进化上高度保守的蛋白质，具有广泛的生物学功能，与HCC的发病关系密切。为了探讨HSP70-2基因多态性与HCC的相关性，我们采用聚合酶链反应-限制性内切酶法对145例HCC患者及127名健康正常人HSP70-2+1267（A/G）PstⅠ酶切位点基因多态性进行了检测。 一、资料与方法 1．研究对象：本院2006年5月-2009年5月就诊的汉族HCC患者145例，其中男性107例，女性38例，年龄21～65岁，中位年龄47岁。患者均经临床、血清学、B 超、CT、磁共振成像及病理学检查确认，诊断符合《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[1]。同时以127名汉族健康体检者为正常对照组。 2．DNA的提取：取抗凝血液2ml，分离单个核细胞后，以蛋白酶K 3．HSP70-2基因的检测：引物序列参考文献[2]，委托上海生工生物工程公司合成，上、下游引物序列分别为5′-CATCGACTTCTACACGTCCA-3′和5′-CAAAGT CCTTGAGTCCCAAC-3′，产物1117bp，其中包含了在1267位置的PstⅠ限制性内切酶的酶切位点。 4．PCR反应条件：在25μl反应体系中，含有2.5μl 1×缓冲液，1.5mmol MgCl2，200μmol dNTPs，1.5U Taq酶，4%二甲亚砜，200pmol引物对，2μl DNA。置于PE9700热循环仪，PCR反应参数为： 5．限制性PstⅠ内切酶酶切检测HSP70-2基因型：取PCR产物15μl，10U PstⅠ内切酶（购自美国Promega公司），2μl缓冲液，水补足20μl。 6．统计学处理：采用直接计数法计算等位基因频率和基因型频率，不同人群组间资料比较采用SPSS13.0统计软件包的卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1．HSP70-2基因多态性PCR内切酶结果见图1。 2．HCC患者和正常人HSP70-2基因检测的结果：HSP70-2的AA、AG和GG基因型频率在HCC患者中分别为33.1%、49.0%和17.9%，在正常人中分别为44.1%、48.8%和7.1%，两组间基因型频率分布差异有统计学意义（χ2＝8.33，P<0.01），见表1。A、G位基因频率在HCC患者中分别为57.6%和42.4%，在正常人中分别为68.5%和31.5%，两组间等位基因频率差异有统计学意义（χ2＝6.9，P<0.01）。 表1 肝癌患者和正常人HSP70-2基因型频率分布 组别 例数 AA（例，%） AG（例，%） GG（例，%） 肝癌组 145 48 (33.1) 71 (49.0) 26 (17.9) 对照组 127 56 (44.1) 62 (48.8) 9 ( 7.1) χ2值 8.33 P值 <0.01 三、讨论 HSP-70作为分子伴侣，参与肿瘤细胞的增殖与凋亡，与HCC的发生、发展、生物学行为以及预后都有密切关系。在HCC发生、形成的不同时期，HSP-70表达水平不同，Chuma等[3]认为，检测HSP-70可作为HCC早期诊断、预后判断及鉴别诊断的分子标志。 在HSP-70编码区内，HSP70-2基因1267位的PstI酶切位点存在着A/G转换，产生了3种不同基因型（AA、AG和GG），该位点基因多态性变化虽然没有改变蛋白质中氨基酸的序列，但能影响mRNA表达。Pociot等[4]发现，在HSP70-2的AA、AG和GG 3种不同基因型中，显现不同水平的mRNA表达，AA基因型显现最高水平的mRNA表达，而GG型则为最低水平mRNA表达。HSP的表达与其不同基因型相关，探讨HSP70基因多态性变化与疾病的关系正逐渐成为研究的热点。近年已有研究者报道了HSP70-2+1267位点基因的多态性与人类多种恶性肿瘤的遗传易感性相关，但结论明显不同。北非的Jalbout等[5]和Chouchane等[6]发现，在非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和鼻咽癌患者中，HSP70-2基因的A等位基因频率增加；中国台湾的Jeng等[7]发现，HSP70-2的A等位基因频率与HCC有关联；而日本的Shibata等[8]却发现胃癌患者中的G等位基因频率增加。以上研究结果显示HSP70-2+1267位点的A/G等位基因对不同的人种、不同组织器官的肿瘤的影响不尽相同。我们的前期研究结果也显示，HSP70基因多态性具有种族和地区差异[9]。所以，进行本地区的疾病与HSP70-2相关性的研究显得更有必要。 本研究结果显示，HSP70-2基因多态性与HCC有相关性，HCC患者和正常人HSP70-2之间的基因型频率分布和基因频率差异明显；HCC患者的G等位基因频率明显高于正常人，G等位基因增加了HCC的易感性。本研究结果与中国台湾Jeng等[7]不同，我们推测这种差异可能与地区不同、研究个体差异或其他因素与HSP70-2基因的协同作用有关，值得进一步研究。 参 考 文 献 [1]Society of Liver Cancer, Chinese Anti-cancer Association. Criteria of the clinicaldiagnosis and staging for primary liver carcinoma. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2001, 9: 324. (in Chinese) 中国抗癌协会肝癌专业委员会.原发性肝癌的临床诊断与分期标准.中华肝脏病杂志,2001,9:324. [2]Milner CM, Campbell RD. Polymorphic analysis of the three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics, 1992, 36: 357-362. [3]Chuma M, Sakamoto M, Yamazaki K, et al. Expression profiling in multistage hepatocarcinogenesis: identification of HSP70 as a molecular marker of early hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2003, 37: 198-207. [4]Pociot F, R鴑ningen KS, Nerup J. Polymorphic analysis of the human MHC-linked heat shock protein 70 (HSP70-2) and HSP70-Hom genes in insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Scand J Immunol, 1993, 38: 491-495. [5]Jalbout M, Bouaouina N, Gargouri J, et al. Polymorphism of the stress protein HSP70-2 gene is associated with the susceptibility to the nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett, 2003, 193: 75-81. [6]Chouchane L, Ahmed SB, Baccouche S, et al. Polymorphism in the tumor necrosis factor-alpha promotor region and in the heat shock protein 70 genes associated with malignant tumors. Cancer, 1997, 80: 1489-1496. [7]Jeng JE, Tsai JF, Chuang LY, et al. Heat shock protein A1B 1267 polymorphism is highly associated with risk and prognosis of hepatocellular carcinoma: a case-control study. Medicine ( [8]Shibata T, Arisawa T, Tahara T, et al. Protective role of genetic polymorphism of heat shock protein 70-2 for gastric cancer risk. Dig Dis Sci, 2009, 54: 70-74. [9]Lin JA, Li WQ, Ye DF, et al. The polymorphism of heat shock protein 70 genes in Chinese Han population in （收稿日期： （本文编辑：黄晨） 中华医学会肝脏病杂志版权 |