【摘要】目的 探讨血管内皮生长因子受体-1（VEGFR-1）在不同转移潜能肝癌细胞株中的表达及其意义。 方法 应用半定量RT-PCR、酶联免疫吸附试验和（或）Western blot检测4株不同转移潜能的肝癌细胞株及一株正常肝细胞中VEGFR-1、VEGF-A、VEGF-B及VEGFR-2的mRNA和（或）蛋白质表达。 结果 MHCC97-H、MHCC97-L和SMMC-7721细胞均有VEGFR-1 mRNA和蛋白质表达，且VEGFR-1 mRNA和蛋白质在MHCC97-H中的表达高于MHCC97-L、SMMC-7721的表达，两者比较，差异有统计学意义（P<0.05），而其配体VEGF-A和VEGF-B在检测的4种肝癌细胞株和正常肝细胞株L-02中均有表达。同时在检测的四种肝癌细胞株和正常肝细胞株L-02中均能检测到VEGFR-2 mRNA和蛋白质表达，但各组间表达差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 具有转移潜能的肝癌细胞株有VEGFR-1表达，而且其表达强弱与肝癌细胞株的转移潜能呈正相关，VEGFR-1的表达可能促进了肝细胞癌的侵袭转移。 【关键词】癌，肝细胞； 血管内皮生长因子受体-1； 侵袭； 转移 The expression and significance of vascular endothelial growth factor and its receptors in hepatocellular carcinoma cell lines with various metastatic potentialities AI Jun-hua, ZHENG Shu-guo, ZENG Yong-yi, XIONG Yan, ZHANG Lei-da, DONG Jia-hong. Southwest Hospital & Institute of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China Email: aijh0001@ 163.com 【Abstract】Objective To examine whether or not vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors were expressed in hepatocellular carcinoma cell lines with various metastatic potentialities. Methods Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blot were employed to study the expressions of VEGFR-1, VEGFR-2, VEGF-A and VEGF-B in four hepatocellular carcinoma cell lines MHCC97-H, MHCC97-L, SMMC7721 and HepG-2 and one normal liver cell line L-02. Results Three hepatocellular carcinoma cell lines (MHCC97-H, MHCC97-L, SMMC7721) expressed VEGFR-1 mRNA and their proteins. The expression level of VEGFR-1 in MHCC97-H was higher than that in MHCC97-L (P < 0.05) and the expression level of VEGFR-1 in MHCC97-L was higher than that in SMMC7721 (P < 0.05). No expression of VEGFR-1 was found in HepG-2 or L-02. All four hepatocellular carcinoma cell lines and the L-02 cell line expressed VEGFR-2 mRNA and the protein, as well as the VEGFR-1 ligands VEGF-A and VEGF-B. The expression level of VEGFR-2 in all tested hepatocellular carcinoma cell lines and normal liver cell line L-02 showed no significant differences (P > 0.05). Conclusion VEGFR-1 was expressed in 4 hepatocellular carcinoma cell lines with various metastatic potentialities. The expression levels appeared to be positively correlated with the potentialities of metastasis of the hepatocellular carcinoma cell lines. VEGFR-1 may relate to the invasiveness and metastatic potential of the hepatocellular carcinoma. 【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Vascular endothelial growth factor receptor-1; Invasion; Metastasis 血管内皮生长因子受体-1（vascular endothelial growth factor receptor-1，VEGFR-1)是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的三个受体酪氨酸激酶之一，是恶性肿瘤血管生成的一个重要调节因子[1]。研究发现，VEGF及其受体与肿瘤的侵袭转移密切相关，其中VEGFR-1促肿瘤侵袭转移的机制除促进肿瘤血管生成以满足快速增长的肿瘤所需的养分和氧供之外，还可通过诱导上皮-间叶表型转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）而促进肿瘤细胞的侵袭转移[2]。肝细胞癌作为富含血管的恶性肿瘤，已证实其VEGF呈高表达[3]，但不同转移潜能的肝癌细胞株VEGFR-1的表达情况如何，鲜见系统研究。在本研究中，我们检测了VEGFR-1在体外培养的4种不同转移潜能的肝癌细胞株及一株正常肝细胞中的表达情况，以进一步认识VEGFR-1在肝细胞癌侵袭转移中的作用及其可能机制。由于VEGFR-1及其配体与VEGFR-2及其配体之间的识别和相互作用存在交叉，因此，我们同时也检测了VEGFR-2、VEGF-A和VEGF-B在上述不同细胞株中的表达。 材料与方法 一、材料 人肝癌细胞株SMMC-7721，MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2及人脐静脉内皮细胞（HUVEC，阳性对照）由第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所保存，人正常肝细胞株L-02由第三军医大学西南医院感染病专科医院刘国栋老师惠赠。胎牛血清和DMEM培养基购自美国HycLone公司。Trizol购自美国Sigma公司，RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司；兔抗人Flt-1多克隆抗体购自美国Labvision公司，小鼠抗人VEGF-B多克隆抗体和Actin兔抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，过氧化物酶标记的羊抗兔FITC-IgG和羊抗小鼠IgG购自深圳达科维公司。人VEGF-A和VEGFR-2 ELISA试剂盒购自上海森雄公司。 二、方法 1. 总RNA的提取及RT-PCR检测各细胞株中VEGFR-1、VEGFR-2和VEGF-B基因表达：（1）细胞培养：用含10%胎牛血清的DMEM培养液在体积分数为5%的CO2、37℃孵育箱中培养，隔日更换培养基，取对数生长期的细胞进行实验。（2）总RNA提取：当细胞融合度达80%左右时，弃培养基，用冰磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤细胞3次，每瓶细胞加入1ml Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA。（3）RT-PCR检测：1μg总RNA（2μl）、Oligo（dT） 0.1μg（1μl）加至DEPC水（5μl）中混匀70℃ 5min后迅速冰浴5min依次加入5×逆转录缓冲液3μl、dNTP Mixture（20mmol/L）2μl、Rnase 1μl、AMV逆转录酶（10U/μl）1μl，经42℃逆转录40min，70℃灭活10min后迅速冰浴1～2min，-20℃保存用作PCR模板。25μl的PCR反应体系包括10×PCR缓冲液2.50μl，25mmol/L Mg2+ 1.50μl，20mmol/L dNTP 0.50μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl） 0.25μl，17.25μl去离子水，上、下游引物（10pmol/μl）各0.25μl，cDNA模板2.50μl。各基因的引物序列见表1。PCR反应条件：94℃预变性5min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。RT-PCR产物分析：10g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统进行图像分析和扫描。 2．双抗体夹心ABC-ELISA法检测各细胞株培养基中VEGFR-2和VEGF-A：4种肝癌细胞株、L-02和HUVEC（阳性对照）应用含10%胎牛血清的DMEM培养液在5% CO2、37℃孵育箱中分别培养（细胞浓度为1×106/L），培养48h后收集细胞上清液，-20℃保存。按ELISA试剂盒说明书检测各细胞株分泌的VEGFR-2和VEGF-A。 3． Western blot法检测VEGFR-1和VEGF-B186（相对分子质量为3.2×104）蛋白质表达: 4种肝癌细胞株、L-02和HUVEC（阳性对照）分别用RIPA“B”蛋白质裂解液［20mmol/L磷酸钠（pH7.4），150mmol/L氯化钠，1% Triton X-100，5mmol/L乙二胺甲乙酸，5mmol/L苯甲基磺酰氟化物，1% aprotinin，1μg/ml Leupeptin，500μmol/L Na3VO4]裂解细胞提取蛋白质，-70℃冰箱保存备用。Bradford分析法测定各细胞株蛋白质浓度[4]。取样品（50μg）每管加入等量2×十二烷基硫酸钠凝胶加样缓冲液，沸水煮5min，8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，60V电泳过夜，25V电转移2h，依次孵育于兔抗人Flt-1多克隆抗体（1∶500）、小鼠抗人VEGF-B多克隆抗体（1∶800）和过氧化物酶标记的羊抗兔FITC-IgG（1∶5000）、羊抗小鼠IgG（1∶3000），二氨基联苯胺显色。 4. 统计学分析：计量资料数据均以x-±s表示，通过SPSS10.0软件进行配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 结 果 1. RT-PCR检测结果：肝癌细胞株MHCC97-H、MHCC97-L和SMMC-7721都有VEGFR-1 mRNA表达（图1），其中MHCC97-H表达最强，灰度值为1822.24±76.87，其次为MHCC97-L，灰度值为1802.69±139.33，且与MHCC97-H相比，表达差异无统计学意义（P＞0.05），SMMC-7721表达最弱，灰度值为1384.48±66.58，且与MHCC97-H、MHCC97-L相比，差异有统计学意义（t值分别为7.46和14.40, P＜0.05），而在肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L-02未检测到VEGFR-1 mRNA的表达。在检测的4种肝癌细胞株和L-02中都有VEGFR-2和VEGF-B mRNA表达（图2，3）。 2. ELISA检测结果：在检测的4种肝癌细胞株和L-02细胞株中，均能检测到VEGF-A和VEGFR-2（表2），其中MHCC97-H分泌VEGF-B最多，L-02分泌最少，且各细胞株与MHCC97-H相比，各组间差异有统计学意义（P＜0.05），而各细胞分泌VEGFR-2差异无统计学意义（P＞0.05）。 表2 （略） 3. Western blot检测结果：在相对分子质量1.8×105附近，MHCC97-H、MHCC97-L、SMMC 7721均呈现阳性条带（图4）。岛津CS-9000薄层扫描结果显示，MHCC97-H的VEGFR-1表达高于MHCC97-L、SMMC-7721，且MHCC97-L、SMMC-7721与MHCC97-H相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。在检测的4种肝癌细胞株和L-02细胞株都有VEGF-B蛋白质表达，但各组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。 表3 （略） 讨 论 VEGFR-1是VEGF的三个酪氨酸激酶受体之一，是结合VEGF（或VEGF-A）的细胞膜锚定的酪氨酸激酶受体。VEGFR-1也是结合VEGF-B和胎盘生长因子的酪氨酸激酶受体。以前认为VEGFR-1主要在血管内皮细胞表达，但新近的研究结果显示在乳腺癌[5]，卵巢癌[6]，前列腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤[7]，胃癌[8]，结肠癌[9]和胰腺癌[10]等许多实体肿瘤细胞也有VEGFR-1表达。起初认为VEGFR-1在VEGF介导的信号转导过程中作用有限，但靶向VEGFR-1的基因敲除研究表明VEGFR-1是发育和生理性血管生成的重要调节因子[11]。 Kanno等[12]用单克隆抗体来阻断VEGFR-1研究，发现VEGFR-1通过调节肌动蛋白重组来影响细胞迁移，并且VEGFR-1与VEGFR-2所引起的信号转导级联反应有所不同，VEGFR-2有明显促有丝分裂和化学趋化活性,在血管通透性升高和血管生成过程中起主要作用，而VEGFR-1在血管生成中的调节作用机制还不十分清楚，可能与调节内皮细胞间作用、内皮细胞与基底膜作用以及内皮细胞的迁移相关。此外，在人胰腺癌、结肠癌和乳腺癌VEGFR-1活化可通过诱导上皮－间叶表型转化而促进肿瘤侵袭和转移[5, 9，10]。 在本研究中，我们检测到4种肝癌细胞和正常肝细胞株L-02都有VEGFR-2、VEGF-A和VEGF-B的mRNA和蛋白质表达，且中度转移潜能的SMMC- 7721和低转移潜能的HepG2细胞与高转移潜能的MHCC97-H、MHCC97-L细胞相比，VEGF-A和VEGF-B的表达差别明显。此研究结果与国内外报道一致。肝细胞癌的不同临床生物学特性可能与其VEGF表达水平不同相关, 即不同肝癌细胞VEGF表达水平的不同决定其生长、转移等特性也不一致, 关于这方面的机制目前尚未明确, 有待进一步研究。 然而，在检测的4种肝癌细胞株和L-02细胞中,MHCC97-H和MHCC97-L高表达VEGFR-1 mRNA和蛋白质，而SMMC-7721的表达很弱，且与MHCC97-H和MHCC97-L的表达有明显差别，而HepG2和L-02没有VEGFR-1 mRNA和蛋白质表达。MHCC97-H和MHCC97-L是高转移潜能的肝癌细胞株[13]，SMMC-7721是中度转移潜能的肝癌细胞株，VEGFR-1的表达很弱，而VEGFR-1活化能促进肿瘤侵袭和转移，它们表达VEGFR-1是否与此有关及其作用机制有待进一步研究，表达于肝癌细胞株的VEGFR-1是否与乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等实体肿瘤一样，通过诱导上皮－间叶表型转化促进肿瘤侵袭转移尚需进一步研究证实。本研究结果表明具有转移潜能的肝癌细胞株有VEGFR-1表达，而且其表达强弱与肝癌细胞株的转移潜能呈正相关，VEGFR-1的表达可能促进了肝细胞肝癌的侵袭转移。 参 考 文 献 [1]Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. 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