【关键词】肝细胞； 干细胞； 细胞移植； 肝，人工；细胞疗法
Research progress in cell-based therapeutics of liver diseases TAN Jia-jun, DING Yi-tao
【Key words】Hepatocytes; Stem cells; Cell transplantation; Liver, artificial; Cell therapy
【First author's address】 Department of Hepatobiliary Surgery, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated to the Medical College of Nanjing University, Nanjing 210008, China
Corresponding author: DING Yi-tao, Email: yitaoding@hotmail.com 肝病的细胞疗法主要用于急、慢性肝功能衰竭和终末期肝病。自上世纪80年代以来，肝移植成为治疗肝功能衰竭和终末期肝病的金标准，但供肝匮乏、费用高以及术后并发症等严重制约肝移植的深入发展。在此形势下，以细胞移植和生物人工肝 (bioartificial liver system，BAL)为代表的细胞疗法为治疗肝脏疾病开辟了一条新途径。
一、肝损伤、修复的机制
1. 损伤机制：各种遗传代谢性疾病以及饮酒、药物、病毒、外伤等原因均能导致肝损伤，甚至引发肝功能衰竭。肝损伤的机制较复杂，简而言之，微血管功能障碍和微循环炎症反应伴随着一系列炎症细胞、肝非实质细胞的激活，炎症因子及趋化因子的释放，导致了肝脏实质细胞的坏死、凋亡，肝功能受损[1]。微血管功能障碍主要指肝血窦内皮细胞激活，血窦舒缩功能障碍和肝血窦血流灌注障碍引发缺氧[2]。微循环炎症反应主要指肝血窦枯否细胞、星状细胞激活后释放白细胞介素（IL）-1、肿瘤坏死因子（TNF）α、血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)、补体等血炎症介质，从而激活内皮细胞并募集白细胞，募集的白细胞一方面通过大量的蛋白水解酶、脂肪酶、糖苷酶、抗菌肽直接或间接溶解细胞膜，另一方面引起氧化应激损伤[3-4]。本实验室的研究结果也显示在骨髓间充质干细胞移植联合炎症抑制因子IL-1Ra治疗急性肝功能衰竭猪后，移植疗效得到明显提高，肝功能恢复良好。
2. 再生修复机制：肝脏具有强大的再生修复功能，部分肝切除后，残留肝细胞可以迅速启动再生程序；而重度肝损伤、肝切除过多时残存肝细胞再生程序受到抑制，肝干细胞被认为是此时肝内的再生修复细胞[5]。现普遍认为肝干细胞来源于Hering管，即胆小管和胆管的连接处，严重的肝脏损伤激活肝干细胞，进而活化、增殖、双向分化为胆管上皮细胞和肝细胞，修复肝脏的结构和功能[6]。
无论移植细胞还是自身肝细胞的功能发挥均受肝脏局部环境因素的影响。目前认为各种生长因子和细胞因子参与了再生修复过程，主要包括：IL-6、TNFα、胰岛素样生长因子1、T3、生长因子、干细胞因子等[7]。简言之，肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和促炎因子是主要的促进肝再生修复的信号组分，而枯否细胞和肝星状细胞是主要的细胞组分。
二、细胞的内源性和外源性修复
内环境紊乱引起肝脏损伤，反之，受损坏死的肝脏又进一步加重内环境的紊乱，这样因果交替的恶性循环造成许多肝脏疾病的进行性加重[8]。有研究结果显示细胞移植可以改变肝内环境状态，打破这种恶性循环。人为地提供肝细胞或干细胞进入肝脏，再生完整肝脏结构和功能成为目前治疗肝病的研究热点[8]。BAL也以肝细胞为基础，体外支持肝功能，改善内环境加速肝再生。
依据细胞疗法的主要治疗机制大体可分为内源性修复和外源性修复两种（图1）。前者指通过成熟肝细胞改善肝损伤的局部内环境稳态，打破恶性循环，促进内源性肝细胞再生修复；后者主要指通过移植干细胞成功植入肝脏，转化为功能肝细胞发挥再生修复功能。主要应用的细胞类型有：（1）肝细胞，包括胚肝细胞与成体肝细胞。（2）干细胞，包括肝干细胞、骨髓来源干细胞[造血干细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）、内皮祖细胞]、脂肪来源 MSC、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）。（3）脐带血/胶质。（4）羊水细胞。
三、内源性再生修复
1. 肝细胞移植：动物实验主要涉及以下三个方面的研究：（1）肝细胞转基因措施不仅包括肝细胞永生化研究，也包括在供体肝细胞内转入抗凋亡基因Bcl-2可避免 FAS诱导的肝细胞凋亡。（2）关于提高肝细胞移植活性的研究，具有提高肝细胞活性和免疫屏障作用的微囊化技术，肝细胞的人工聚合物修饰和肝细胞人工支架黏附等[9-11]。研究结果显示这些措施可以提高移植肝细胞的存活率。虽然移植6～9个月后在受体肝脏内很难再找到供体肝细胞，但肝细胞的治疗机制决定了我们应该加强其在短期内充分发挥合成代谢分泌功能，充分发挥短期效益。（3）立即获得大量有功能的肝细胞对治疗急性肝功能衰竭患者尤为重要。冻存大量肝细胞是一种可取的方法。冻存液为含10% DMSO（二甲基亚砜）和10%葡萄糖的UW液(一种细胞、器官保存液)。细胞多采用高密度冻存法（1.0 × 107/ml～1.5 × 107/ml），以便使用时大量细胞快速同时复苏[12]。冷冻前肝细胞与葡萄糖、果糖或者硫辛酸预培养可以提高复苏后细胞的活力和功能[13]。虽然冻存复苏技术在一定程度上解决了大量肝细胞来源问题，但复苏后肝细胞活性降低了30%，并且细胞间黏附效率显著降低，这似乎与细胞表面黏附分子的丢失有关，如何降低甚至消除上述问题是亟待解决的难题。
临床试验进展：在过去的20年里，各中心进行了较多的临床肝细胞移植治疗。2000年Bilir等[14]报道5例急性肝功能衰竭患者接受肝细胞移植，其中3例脑水肿、毒血症所致的急性肺功能衰竭得到明显好转。早期也有研究者进行胎肝细胞的临床实验，例如，1994年Habibullah等报道7例急性肝功能衰竭患者接受腹腔人胎儿肝细胞移植，结果提示早期肝细胞移植对急性肝功能衰竭治疗有效。Mito等[15]报道10例Child C级肝硬化患者行脾内自体肝细胞移植，术后患者康复良好，1个月后其中8例患者可用放射性核素在脾脏中检测出肝细胞。1996年3例酒精性肝硬化患者接受了肝细胞移植，4年后随访患者均健在；其中1例存在Ⅲ期肝性脑病的终末期肝病患者接受了7.5×106个冻存肝细胞移植，术后肝性脑病症状减轻，血氨水平降低。这些临床研究结果表明，肝细胞移植既有可能使终末期肝病患者恢复肝功能，又可延长患者生存期，使进一步肝移植成为可能。
2. BAL：即在功能肝细胞的基础上进行体外肝功能的替代，改善体内微环境以恢复内稳态，为体内肝细胞再生和肝移植创造时间和环境条件。尽管BAL发展迅速，但面临的主要问题还是细胞来源和生物反应器研制两方面。缺乏最合适的细胞来源，也许是大多数BAL没有引入大规模临床试验的原因。
目前全球有众多生物人工肝装置处于动物实验阶段，也有少数进入了临床试验。体外肝辅助装置(extracorporeal liver assist device，ELAD)是基于C3A细胞株的中空纤维管式生物反应器，Pless[16]开展了第一次随机对照临床试验，结果显示ELAD治疗组的动脉血氨和血清胆红素水平均比对照组低，且肝性脑病也要比对照组轻，但未能改善生存率。本研究所在第一代生物人工肝系统的基础上成功研制出一款基于纳米纤维支架的多层平板式生物反应器，均进行了大量动物实验及Ⅰ期临床试验。2002年和2011年10月分别治疗16例次和12例肝功能衰竭患者[17]；目前临床研究还在进行中。
四、外源性再生修复
干细胞因其强大的增殖、多向分化能力受到广泛应用，研究者认为移植干细胞可通过分化为功能肝细胞治疗肝功能衰竭。目前也有研究证实MSC等干细胞能分泌多种细胞因子促进内源性肝细胞再生修复[18]。因此，移植细胞很可能同时具备促进内源性肝细胞再生和干细胞分化修复肝损伤双重作用。
1. 细胞来源：（1）肝内干细胞（卵圆细胞）：在严重肝损伤抑制了内源性实质肝细胞再生时，位于胆小管和胆管之间的卵圆细胞帮助肝脏再生修复。卵圆细胞表达早期肝细胞标志物甲胎蛋白、胆管上皮细胞标志物CK19和成熟肝细胞标志物白蛋白。卵圆细胞是一种肝内的祖细胞，具有分化为肝细胞和胆管细胞的双重能力[5]。（2）ESC：作为一种全能干细胞，强大的增殖和分化能力带给人们无限的憧憬。一项研究给3只肝脏严重损伤的老鼠进行脾脏或肝脏ESC来源的肝样细胞移植，结果肝纤维化的发生推迟，肝功能得到显著提高。ESC虽然研究前景良好，但除了体外最佳诱导分化体系缺乏外，潜在的致瘤性和伦理上的问题同样制约人的ESC研究[19]。（3）骨髓源性干细胞：Petersen等[20]和Theise等[21]相继指出骨髓源性Msc或造血干细胞能够在受体肝脏内转化为肝样细胞。将鼠的骨髓干细胞经尾静脉注射移植入(NOD)/SCID鼠体内也发现干细胞转分化为肝样细胞。这些研究结果显示了骨髓来源干细胞的可塑性。但骨髓细胞成分复杂，何种细胞更适合用于肝细胞再生尚不清楚。Sato等[22]比较了三种人骨髓细胞，分别直接移植到大鼠肝内，检测肝细胞特异性标志物，结果表明骨髓MSC显示出最强的向肝细胞分化的潜能。以上实验为MSC移植治疗终末期肝病提供很好的思路。（4）iPS细胞：通过导入特定的转录因子可将分化的体细胞重编程为iPS细胞，这种去分化细胞和ESC一样是一种多能干细胞，因而可以说这项技术避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题，是生命科学领域的一次巨大革命。自2006年Takahashi等[23]首次将鼠成纤维细胞诱导成iPS细胞后，又相继有不同成体细胞诱导为iPS细胞的报道。2009年日本东京大学研究员将培养的iPS细胞再分化为巨核细胞，进一步培育出了血小板。说明用 iPS 细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。这也为以后培育出成熟肝细胞奠定了基础。2009年9月，斯坦福大学研究人员Sun等[24]发现，与皮肤成纤维细胞相比，脂肪干细胞更容易被诱导为iPS细胞，在相同的诱导体系下后者是前者的20倍。同时发现培养氧浓度、添加特殊的化学物质甚至维生素C均会影响iPS的诱导效率。值得注意的是，不同体系对各种体细胞的诱导能力不同，这提示在今后iPS的应用中应选择最佳的体细胞来源和和对应的体系。
2. 围移植期处理：移植前后对移植细胞和宿主给予一系列特殊处理的主要目的在于提高移植存活率，使干细胞成功植入肝血窦进入实质区，进而分化为成熟肝细胞。
（1）细胞预处理：干细胞微囊化：微囊化移植理论上为干细胞提供理想内环境，避免体内有害损伤，可以促进移植效率。对裸MSC和微囊化MSC移植小鼠体内进行比较，结果后者小鼠存活率显著提高，移植后的微囊化 MSCs 可以长期生长；随培养时间增加，MSCs 会向肝实质细胞样细胞转化[25]。MSC细胞低氧预处理：传统MSC细胞的体外培养是在常氧状态（21%氧含量），然而MSC细胞存在的骨髓等天然环境是超低氧状态。移植MSC细胞提前在1%～3%氧含量的条件下培养，可以提高肝细胞生长因子受体cMet的表达，促进移植后干细胞的迁移，促进局部缺血组织的血管新生和血流恢复等[26]。
（2）宿主处理：①在移植前宿主接受一定剂量的辐射或（和）给予野百合碱、胆酸预处理以破坏血窦内皮细胞屏障。②四氯化碳、缺血再灌注损伤或者部分肝切除以造成宿主肝细胞的损伤、抑制自身细胞的增殖，从而可能促进移植细胞的植入和增殖。③给予一些特殊的化学试剂（农吉利碱）抑制内源性肝细胞在再生刺激信号下的DNA复制。④给予一定的免疫抑制控制。一般②③措施联合使用可以有效达到增加移植细胞植入率和转化率的效果。
3. 干细胞临床研究：因自体MSC细胞获取方便，易于体外培养，无免疫排斥反应且安全可靠，使得自体MSC移植在多系统受到广泛应用。3例肝肿瘤患者的临床病例显示：在存在肿瘤的肝叶进行静脉栓塞后，对侧肝叶行自体MSC移植，移植患者较未移植患者肝叶增大2.5倍，更有利于肝切除[27]。另有25例丙型肝炎肝硬化患者分别行自体MSC移植和常规治疗，结果移植组较对照组在肝功能指标、MELD评分方面均有显著改善[28]。国内临床研究也有类似效果，王帅等[29]及潘兴南等[30]分别报道了80例和24例终末期肝病患者接受自体骨髓干细胞移植，随访至术后12周，所有患者肝功能均较术前明显好转，而白蛋白较术前有所上升。
五、细胞疗法的局限性
大量肝细胞来源问题是其主要局限。其次，冷冻肝细胞活力不足，功能减退，并需要多次移植，严重影响移植细胞疗效。干细胞众多的优点使其成为新的热点，但目前还没有研究结果显示干细胞比早期成熟肝细胞移植有更好的疗效。尽快研究提高干细胞移植治疗效果的方法是突破局限性的关键，不要拘泥于改善一些反映移植细胞状况的参数上，治疗效果才是反映干细胞有用与否的最终指标。
细胞移植并发症较危险，如细胞迁移引起的肺栓塞；心、脑、肾等重要器官中存在迁移的移植细胞，对机体有否远期影响尚不得而知。
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(本文编辑：朱红梅） 中华医学会肝脏病杂志版权 |
