【摘要】 目的 鉴定肝癌患者血清差异表达蛋白并在肝癌细胞和组织中验证肝癌潜在标志物Clusterin的表达水平。 方法 运用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）结合LC-MALDI-TOF/TOF串联质谱技术，分析20例肝癌患者与20例健康对照的血清中差异蛋白的表达水平；用实时定量 RT-PCR检测潜在标志物Clusterin在肝癌细胞和30对肝癌和癌旁组织中mRNA表达水平；Western blot检测Clusterin在肝癌细胞中的表达水平。肝癌细胞株与正常肝细胞株均数的比较采用两样本t检验，肝癌组织和癌旁组织均数的比较采用配对t检验。 结果 利用iTRAQ结合质谱分析共发现显著差异表达蛋白51个，其中Clusterin在肝癌患者血清中表达下调；RT-PCR结果显示，Clusterin在正常肝细胞中的mRNA表达水平是肝癌细胞中表达水平的20倍（t = -3.482，P = 0.0017），癌旁组织中的mRNA表达水平是肝癌组织中表达水平的2.38倍（t = -2.840，P = 0.0086）；Western blot检测Clusterin在肝癌细胞和正常肝细胞中的吸光度值分别为8.06和27.81（t = -3.256，P = 0.0015），在肝癌细胞中的表达明显降低。 结论 Clusterin在肝癌患者血清、肝癌细胞和组织中的mRNA表达水平和在肝癌细胞中表达水平均为下调，其与肝癌的关系值得进一步研究。
【关键词】癌，肝细胞； 生物学标记； 诊断技术和方法； Clusterin Clusterin is a potential serum marker of hepatic carcinoma LI Yin, ZHANG Qin-le, YANG Xiao-li, LI Gang, HE Xiao, ZHOU Yi, ZANG Ning, LUO Rong, LI Hong-tao, LIAO Ming, WANG Yun, ZHANG Xue-rong, HE Min. School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
Corresponding author: HE Min, Email: m_h_m868@sina.com
【Abstract】 Objective To determine the differentially expressed serum proteins in patients with hepatoma carcinoma and identify a putative diagnostic marker. Method The isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) labeling method and LC-MALDI-TOF/TOF MS detection method were used to quantify serum proteins in hepatocellular carcinoma patients (n = 20) and healthy individuals (n = 20). Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction was used to verify the differentially expressed proteins by analyzing the corresponding mRNA expression levels in the hepatic carcinoma and healthy hepatocyte samples, as well as in 30 pairs of patient-matched hepatic carcinoma and adjacent normal tissue samples. Western blot analysis was used to verify the protein expression in hepatic carcinoma cells. Results Fifty-one proteins were significantly differentially expressed between the hepatic carcinoma group and healthy controls. The iTRAQ protein profile showed that the serum level of clusterin was significantly lower in hepatoma carcinoma patients. The mRNA level of clusterin was 20-fold lower in hepatic carcinoma cells than in healthy hepatocytes, and was 2.38-fold lower in hepatoma tissues than that in adjacent normal tissues. The clusterin protein levels were significantly lower in hepatic carcinoma cells (8.06 vs normal hepatocytes: 27.81; P < 0.01). Conclusions The serum expresion of clusterin is significantly decreased in both serum and tissues of hepatic carcinoma patients. The relationship between hepatic carcinoma and clusterin should be evaluated in future studies.
【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Biological markers; Diagnostic techniques and procedures; Clusterin 同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术是近年来开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，结合MALDI-TOF-TOF串联质谱可对血清、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究，是一种理想的寻找生物标记的技术[1]；该技术已被应用于乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等血清标志物的研究[2-4]。本研究中，我们应用iTRAQ标记结合MALDI-TOF/TOF生物质谱技术筛选和鉴定肝癌血清差异表达蛋白，并验证潜在标志物在肝癌细胞和组织中的表达水平。
资料与方法
一、iTRAQ标记串联质谱分析肝癌血清中的差异表达蛋白
1. 研究对象与分组：肝癌患者为广西医科大学附属肿瘤医院2009年7-8月期间住院患者20例，临床诊断为原发性肝细胞癌且没有经过治疗的患者，诊断标准符合中国抗癌协会肝癌委员会2001年9月广州会议制订的的原发性肝癌临床诊断与分期标准[5]。正常对照来自同时期广西医科大学第一附属医院的健康体检者，既往无肝脏疾患，肝脏B型超声，肝功能检查未见异常，在全身体格检查中未发现其他疾病。将AFP水平> 400μg/L的肝癌患者设为肝癌组1，AFP水平< 400μg/L但高于正常水平的肝癌患者设为肝癌组2，每组10例；相对应的，选择性别、年龄等方面与肝癌患者匹配的正常体检者20例分别与肝癌组患者一一对应。并设为健康对照组1、对照组2。所采集的血清标本置于-80 ℃冰箱分装保存。
2. 去除血清中高丰度蛋白：按照多重亲和去除色谱柱Human14，Agilent公司强阳性离子交换柱（购自美国PolyLC公司）操作程序，去除高丰度蛋白，收集到的馏分用旋转浓缩器浓缩，BCA法测定蛋白含量，0.5 g/L上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测样品中高丰度蛋白的去除情况。
3. 蛋白酶解、iTRAQ标记、色谱分离与点靶：参考文献[6]方法，按仪器操作手册进行。
4. 质谱分析及数据库检索：多肽的串联质谱鉴定和相对定量分析用4800Plus MALDI-TOF/TOF质谱分析仪（购自美国AB公司）。质谱分析数据用ProteinPilot（2.0版，购自美国AB公司）对NCB Inr数据库进行蛋白检索鉴定，报告置信度在95%以上的蛋白质同时用m/z114、115、116、117报告离子的峰面积积分进行相对定量分析，以m/z114为对照，按115∶114、116∶114、117∶114的比值，选择P≤0.05的结果进行报告。对有一个以上高置信度（不低于99%）惟一多肽匹配的蛋白不再进行人工确认，对不含高置信度（不低于99%）惟一多肽匹配的蛋白，用手工方法对MS/MS图谱碎片离子进行检查确认。
二、RT-PCR检测Clusterin在细胞和组织中mRNA的表达水平
1. 细胞培养：人肝癌细胞株SMCC-7721和人正常肝细胞株HL-7702由广西医科大学医学科学实验中心肿瘤实验室提供。所有细胞株均用含10%胎牛血清和1%青霉素与链霉素的1640培养液，在37 ℃、5% CO2和一定湿度的培养箱中体外孵育。
2. 组织标本：采集2007年1月至2008年1月期间在广西医科大学第一附属医院肝胆外科住院患者外科手术切除标本30例。所有肝癌组织经HE染色病理学证实均为癌性。癌旁组织是与癌组织边缘相距大于5.0 cm的癌周围肝组织，病理学检查结果证实均为正常肝组织。
3. 引物设计：Clusterin F：GAATGGTGACCG
CATCGACT，R：CTGAAGGGCAGGTAG TGGTA
GG，产物168 bp；内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因F：CAAGGTCA TCCATGACAAC TTTG，R：GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG，产物496 bp。所有的引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。
4. RNA提取和逆转录反应：TRIzol试剂提取细胞和组织总RNA，10 g/L琼脂糖凝胶检测RNA的完整性，紫外分光光度计检测RNA纯度。在反应体积为20μl的逆转录管中，5μg的总RNA，1μl Oligo（dT）18Prime，双蒸水补足体系至12μl，65℃温育5 min，降温至0 ℃，加入5 × 缓冲溶液4μl，RNase inhibitor 1μl，10 mmol/L dNTP mix 2μl，逆转录酶1μl，混匀后42 ℃温育4 h，70 ℃10 min灭活逆转录酶，终止反应。
5. YBRGreen实时荧光定量PCR：按以下体系进行操作：SYBR Green 10μl，2μl cDNA模板，0.4μl ROX，引物各0.8μl，用双蒸水补足体系至20μl。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，共40个循环。独立实验重复3次，ABI Prism 7300 SDS 软件分析，通过Comparative Delta-delta Ct法对细胞和组织中Clusterin的mRNA的表达水平进行相对定量分析。
三、 Western blot检测Clusterin在肝癌细胞中的表达
收集人肝癌细胞株SMCC-7721和人正常肝细胞株HL-7702，加细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白。取50 g总蛋白进行电泳。置10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白后，电转移至聚偏氟乙烯膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入1∶1 000稀释的第一抗体（鼠抗人单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司）。1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的第二抗体（抗鼠IgG，购自美国ZYMED公司），常规曝光、显色及定影。扫描胶片，用Odyssey红外荧光成像系统软件进行蛋白定量分析。
四、统计学方法
用SPSS13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，肝癌细胞株与正常肝细胞株均数的比较采用两样本t检验，肝癌组织和癌旁组织均数的比较采用配对t检验。均数及t检验要求数据满足正态性分布。P < 0.05为差异具有统计学意义。
结 果
1. iTRAQ标记结合MALDI-TOF-TOF串联质谱分析：在iTRAQ标记中，114、115、116、117分别标记的是肝癌组1、肝癌组2，对照组1和对照组2。肝癌患者血清和正常人血清中筛选和鉴定出303个蛋白。两组比较，表达差异明显的蛋白51个，与正常组比较，在肝癌血清中表达显著升高的蛋白23个，表达显著降低的蛋白28个。其中Clusterin在两组肝癌血清中都表达降低。显示8段高置信度（不低于99%）惟一匹配Clusterin的蛋白多肽及其相对表达水平（表1）。
2. 实时定量RT-PCR检测Clusterin mRNA在细胞和组织中的表达水平：（1） Clusterin的mRNA在细胞中表达水平：在人肝癌细胞株SMCC-7721和人正常肝细胞株HL-7702中，mRNA的表达水平如图1所示，Clusterin的mRNA在肝癌SMCC-7721细胞中的表达水平相对于正常肝细胞株HL-7702细胞表达下调，后者是前者的20倍， 经t检验， t = -3.482， P = 0.0017，差异有统计学意义。（2）Clusterin mRNA在肝组织中的表达水平：30对肝癌组织和癌旁组织配对检测mRNA的表达水平经计算，Clusterin的mRNA在肝癌组织中的表达水平下调，癌旁组织表达水平是肝癌组织的2.38倍（图1），经配对t检验，t = -2.840，P = 0.0086。差异有统计学意义。Clusterin的mRNA表达水平无论在肝癌细胞还是组织中均为明显下调，与iTRAQ标记的质谱检测血清结果一致。
3. Western blot检测Clusterin蛋白在肝癌细胞中的表达：Western blot 结果见图2。与正常肝细胞株HL-7702比较，Clusterin在肝癌细胞株SMCC-7721细胞中的表达水平显著低于正常肝细胞株HL-7702，Clusterin在二者中的吸光度值分别为8.06和27.81，t = -3.256，P = 0.0015，差异有统计学意义。
讨 论
肝癌是我国最常见、最具有危害性的恶性肿瘤之一。目前的肝癌血清标志物仍不够理想,探求新的对肝癌敏感、特异的血清标志物及新的诊断模式，是目前临床亟待解决的难题。
Clusterin是一种具有多种生物学功能的异二聚体糖蛋白，在不同物种间具有高度同源性[7]。Clusterin也被称为SGP-2（sulfatedglycoprotein）、TRPM-2（testosterone-repressed prostate message 2），在人体许多组织中表达，并广泛存在于人类的体液中[8]。Clusterin蛋白参与了多种重要的生理功能，如细胞-细胞及细胞-细胞外基质间的相互作用、细胞氧化应激、细胞运动、细胞增殖、细胞凋亡、分子伴侣、炎症等[9]。Clusterin基因的启动子上存在“热休克元件”，对外界应激应答，对细胞具有保护作用，因此，有人认为Clusterin为一种新型的热休克蛋白[10]。
Zhang等[11]利用双向电泳结合质谱鉴定，发现Clusterin在食管鳞状细胞癌患者血清和癌组织中下调，并用半定量RT-PCR和western blot验证其在癌组织中表达的下调。本研究结果与上述结论相似，Clusterin在肝癌患者血清中表达下调，提示Clusterin可能为肝癌潜在的标志物。除此之外，近年还有一些研究者报道Clusterin在癌组织中表达下调[12]。Caporali等[13]发现，Clusterin下调与TRAMP小鼠自发性前列腺癌发生和进展相关，从而提出Clusterin可能是一种肿瘤抑制因子。Yang等[14]报道在神经母细胞瘤中，分泌性Clusterins下调被发现与肿瘤发生和转移有关。
但亦有报道，Clusterin在膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤中表达上调。为什么会出现两种矛盾的结果？究其原因，是因为Clusterin蛋白有两种存在方式：成熟分泌型Clusterin（sCLU）和细胞核型Clusterin（nCLU）。前者过量表达出现在毒物引起的凋亡过程中，后者扮演细胞死亡前信号，抑制细胞存活与生长[15]；nCLU通过影响DNA非同源修复，导致基因组的不稳定性或细胞的死亡[14]；诱导Clusterin mRNA和蛋白高表达与细胞死亡的出现一致，nCLU可能是程序性细胞死亡的一个标志[16]。因此，这两种不同亚型的Clusterin分别发挥抗凋亡和促进凋亡的作用[17]。同时还发现，癌细胞中不同亚型的Clusterin表达水平与肿瘤细胞的侵袭能力有一定的关联，肿瘤的发生和发展与sCLU的过表达和nCLU的缺失有关。Clusterin的两种蛋白亚型在某些情况下还可以发生相互转化，当肿瘤向更高恶性度和高转移性发生演进的同时，可出现nCLU向sCLU的转化[18]。由于Clusterin在肿瘤生长中的不同作用可能与它的不同亚型有关，Clusterin及不同亚型在恶性肿瘤发生和发展过程中的作用，以及与肝癌临床不同病理类型、不同病程、原发与转移等的相关关系，还有待今后进一步研究。
参 考 文 献
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（本文编辑：金生） |
