【摘要】 目的 研究HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸变异对HBsAg抗原性的影响。 方法 定点突变HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸对应的s基因(P120T、C121S、K122I和T123N)，构建4个真核表达重组质粒。用重组质粒和表达G145R HBsAg质粒体外瞬时转染HepG2细胞。4种抗体和7种国产HBsAg ELISA诊断试剂盒检测转染细胞上清液和细胞裂解液中变异HBsAg的免疫反应性；免疫荧光检测单克隆抗体与转染细胞内变异HBsAg的免疫反应性。 结果 成功构建了表达HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸变异的重组质粒，P120T、C121S、K122I和T123N变异HBsAg的免疫反应性比野生HBsAg低，T123N变异导致HBsAg存在分泌障碍。 结论 HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸对维持HBsAg的空间构象和抗原性具有重要作用。
【关键词】 肝炎表面抗原，乙型； 变异； 抗原性
Antigenicity of major hydrophilic region II of hepatitis B virus surface antigen TIAN Yong-jun*, ZHANG Zheng-mao, XIA Chang, LIU Shen-pei, YU Yuan, HUANG Hong-ping, YANG Yan, LU Meng-ji, YANG Dong-liang. *Division of Clinical Immunology, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Corresponding author: YANG Dong-liang
【Abstract】 Objective To study whether the substitutions at the major hydrophilic region II (MHRII) of hepatitis B surface antigen (HBsAg) will impair the antigenicity of HBsAg. Methods Four recombinant plasmids expressing mutant HBsAg (mtHBsAg) P1120T, C121S, K122I and T123N were constructed. HepG2 cells were transfected with the four plasmids and a plasmid expressing G145R HBsAg. The immunoreactivity of the cells expressing mtHBsAg with P1120T, C121S, K122I, T123N and G145R were detected by immunofluorescence (IF) staining and ELISA with 4 antibodies and 7 HBsAg diagnostic kits respectively. Results mtHBsAg with P120T was recognized by mAb1 and mAb2. mtHBsAg with C121S and K122I was not recognized by any mAbs. mtHBsAg with T123N in lysates was recognized by mAb2, but not recognized in the supernatants. Conclusion Substitutions at amino acid positions 120-123 of HBsAg strongly impaired the antigenicity of HBsAg, a fact that was not appreciated previously.
【Key words】 Hepatitis B surface antigen; Variant; Antigenicity
HBsAg变异给HBV的诊断和预防带来了新问题[1-3]。HBsAg暴露在表面的由99～169位氨基酸组成的区域，称为主要亲水区（major hydrophilic region, MHR）。Carman[3]将MHR又分为5个区：Ⅰ区从99到119位氨基酸，Ⅱ区从120到123位氨基酸，Ⅲ区从124到137位氨基酸，Ⅳ区从139到147位氨基酸，Ⅴ区从148到169位氨基酸。“a”决定簇是由HBsAg 124～137位和139～147位的半胱氨酸以二硫键相连形成两个环，构成具有特定空间构型的结构[3-6]，是HBsAg刺激B细胞产生抗体以及诊断的最重要的表位，是中和抗体结合的表位。所有血清型的HBsAg都有共同的“a”决定簇。表面抗原变异主要发生在“a”决定簇,比如常见的Gly145Arg变异[1，3，7，8]。“a”决定簇的变异可导致HBsAg抗原性的改变，用目前针对野生毒株“a”决定簇的单克隆抗体制备的诊断试剂盒不能测及。新近的研究以及本室的研究结果表明“a”决定簇以外的主要亲水区发生的变异，比如MHRⅡ区的K122I、T123N及MHRⅥ区R/K160N变异，也可以显著影响HBsAg的抗原性[9-11]。这些区域氨基酸变异对HBsAg抗原性影响的相关研究较少。根据前期研究基础，我们推断MHRⅡ区的4个氨基酸对维持HBsAg的特定空间构象和抗原性具有重要作用。本研究通过定点突变的方法分别改变MHRⅡ区的4个氨基酸，体外真核表达变异HBsAg，检测其抗原性。
材料与方法
1. 细胞、菌株和主要试剂：大肠杆菌DH5α、HepG2细胞为本室保存。真核表达载体pXF3H由美国Baylor大学细胞生物学系冯新华教授惠赠，该载体表达的外源性蛋白质N末端带有血凝素标记；重组质粒pXF3H-S145为本室构建的表达G145R HBsAg的重组质粒。抗-HBs单克隆抗体mAb1和mAb2由本研究室制备，抗-HBs145单克隆抗体由德国ESSEN大学病毒研究所惠赠；HRP标记抗-HBs多克隆抗体购自上海科华实业生物有限公司；兔抗血凝素多克隆抗体、HRP-羊抗兔IgG及FITC标记的兔抗鼠IgG购自美国Santa Cruz公司。限制性内切酶EcoRⅠ、PstⅠ、T4连接酶、高保真LA DNA聚合酶、质粒小量制备试剂盒购自大连宝生物公司。转染试剂lipofectimaneTM reagen购自美国Invitrogen公司。DMEM培养基购自美国Gibco公司，7种国产HBsAg诊断试剂盒分别购自7个生产厂家，分别以KitA、KitB、KitC、KitD、KitE、KitF和KitG表示。
2. 重组质粒的构建和鉴定: 根据HBV s基因的序列和pXF3H载体多克隆位点中的内切酶位点顺序，设计出针对HBV s基因的一对引物（SP1和SP2）, 另设计4条带有突变位点的引物（P120TL、C121SL、K122IL和T123NL），再设计一条与任何突变位点都不重叠的位于120位氨基酸上游一条公用引物（T-primer），引物位置及序列见表1。引物由上海博亚生物公司合成。
以本室构建表达野生型HBsAg（adw）重组质粒pXF3H-HBS为模板，分别由s基因的上游引物SP1和公用引物T-primer扩增上游片段；s基因下游引物SP2分别和4条诱变引物进行PCR扩增下游片段。第1次扩增反应体系：MgCl2 2mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物1μmol/L，LA taq酶2.5U，总体积50μl。反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 45s，72℃ 1min, 30 个循环；72℃延伸10min。再分别将两次PCR产物分别纯化、混合，然后再利用s基因的上、下游引物SP1和SP2进行PCR。第二次扩增反应体系：MgCl2 2mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物1μmol/L，LA Taq酶2.5U，总体积50μl。反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min。获得的PCR产物即为含有突变位点的大小约700bp的基因片段。用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ分别酶切PCR片段和pXF3H载体，分别回收4个目的基因和载体，再分别进行连接反应，转化感受态大肠杆菌DH5α。挑取转化后的单菌落接种于1ml LB（含100μg/ml氨苄青霉素）中培养，碱裂解法抽提质粒，EcoRⅠ和PstⅠ酶切鉴定，选取能切下700bp大小的DNA片段的克隆送上海博亚生物公司测序，证实目的位点引入了突变。用质粒小量制备试剂盒制备重组质粒，-20℃保存备用。
3. HBsAg的体外瞬时表达: 利用脂质体介导插入重组质粒转染HepG2细胞。在12孔板中接种对数生长期的HepG2细胞，16h后细胞达到60%～80%融合时，5种质粒各取1.0μg，与2.5μl LipofectamineTM用Opti-MEM培养基（美国Invitrogen公司）稀释至总体积50μl，按转染说明书操作。48h后收集细胞培养上清液。转染实验重复4次。
4. 制备细胞裂解液：细胞表达的变异HBsAg可能会导致分泌障碍，检测不到细胞上清液存在HBsAg。转染48h后的细胞用4℃预冷PBS洗3次，加入1ml PBS，将细胞刮下，收集于EP管中6000r/min离心2min，弃上清液。加500μl PBS悬浮细胞，在-70℃反复冻融3次，12000r/min离心2min，收集上清液保存。
5. Western blot检测变异HBsAg的表达水平：为证实转染后细胞表达的HBsAg水平一致，我们采用Western blot检测表达在HBsAg N末端的血凝素标记。细胞转染48h后，用预冷PBS洗3次，刮起细胞并转移至预冷的EP管中，超声波破碎。4℃离心，12000×g离心10min，收集上清液，-20℃保存备用。采用BCA法测定细胞总蛋白质浓度。上样前加入等量2×SDS加样缓冲液煮沸10min，50μg蛋白质样品用12% SDS-PAGE电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜，3% BSA室温封闭1h，兔抗血凝素多克隆抗体(1∶300)室温孵育1h，含0.05% Tween20的TBS洗15min×3次，HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5000)室温孵育1h，含0.05% Tween20的TBS洗15min×3次，加入化学发光试剂ECL，暗室暴光，冲片观察结果。
6. 7种HBsAg检测试剂盒检测表达的HBsAg反应性：7种HBsAg诊断试剂盒均为国内生产，所有检测试剂盒均使用单克隆抗体包被，多克隆抗体检测模式。以转染细胞培养上清液和细胞裂解液为样品，按照试剂盒说明书进行。比色后计算S/N值（S/N值=样品A值/阴性对照A值），S/N值≥2.1为阳性。各个样品的S/N值分别表示其与7种检测试剂的反应性。为了减小实验中细胞转染效率和表达水平差异带来的误差，将4次转染样品检测结果的均值表示反应性结果。
7. 3种抗-HBs单克隆抗体和多克隆抗体与变异HBsAg的反应性：2种抗-HBs单克隆抗体为本室制备，识别HBsAg 110～160位氨基酸组成的构象性表位，且与多种变异HBsAg的反应模式不同（资料另文发表）。抗-HBs145单克隆抗体可特异性识别HBsAg 145位甘氨酸变异为精氨酸后形成的表位。3种单克隆抗体和多克隆抗体分别以1μg/ml的浓度包被ELISA反应孔，4℃过夜，用含5%小牛血清的PBS 37℃封闭2h。加入转染后细胞培养上清液和细胞裂解液50μl于各孔，37℃，1h；PBS（含0.05% Tween20）洗板5次；各孔加入HRP标记抗-HBs多克隆抗体，37℃孵育45min；PBS（含0.05% Tween20）洗板5次；加TMB显色剂，37℃显色15min，终止反应后用450nm波长比色，计算S/N值（S/N值=样品A值/阴性对照A值）。S/N值表示其与抗体的反应性。
8. 免疫荧光检测细胞内变异表面抗原：接种在Chaber-Slides中的HepG2细胞转染后继续培养48h，然后用50%甲醇PBS溶液4℃固定15min；加0.25%的Triton X-100，5min，PBS洗1次；分别用mAb1和mAb2抗体（1∶200稀释）37℃孵育1h，PBS洗3次；加FITC标记的兔抗鼠IgG（1∶100稀释）37℃孵育1h，PBS洗3次。加入碘化丙啶（propidine iodide，PI）染液（RNase 300μg/ml，PI 50μg/ml，1% Triton X-100，EDTA 10mmol/L）到玻片上，37℃避光孵育30min，PBS洗3次，5min/次。30%甘油封片，激光共聚焦显微镜（Leica，德国）荧光观察照相。
结 果
1. 表达HBV MHRⅡ变异表面抗原的真核表达质粒的构建和鉴定：以本室构建的pXF3H-HBS为模板，分别以s基因的上游引物SP1和T-primer及下游引物SP2和4个内侧诱变引物进行PCR，分别得到4条长度为380bp和340bp大小的DNA片段，与预期相符。将各片段回收、纯化后以对应两条的混合物为模板，以SP1或SP2为引物进行第2轮PCR，得到一条约700bp的DNA片段，将此片段回收并纯化，用EcoRⅠ和PstⅠ酶切后，插入到pXF3HA载体上的EcoRⅠ和PstⅠ位点间。转化DH5α大肠杆菌后，对阳性菌落进行扩大培养后小量制备重组质粒，再用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切鉴定，结果符合预期结果。酶切正确的重组质粒测序后表明在120aa处实现CCA→ACA的改变，121aa处实现TGC→AGC的改变，122aa处实现AAG→ATC的改变，123aa处实现ACC→AAC的改变。
2. Western blot检测HBsAg的表达：Western blot检测表达变异HBsAg在N末端的血凝素标记，结果显示各变异HBsAg与野生HBsAg的表达水平一致（图1）。
3. 变异HBsAg与单克隆抗体和多克隆抗体的反应性：抗-HBs单克隆抗体mAb1和mAb2，识别HBsAg由110～160位氨基酸组成的构象性表位，与变异HBsAg的反应模式不同（结果另文发表），mAb1与包括G145R在内的多种变异HBsAg有较好的反应性。用这2种单克隆抗体ELISA检测转染细胞上清液或细胞裂解液变异HBsAg。结果显示，mAb1与P120T的反应性与野生型HBsAg相似，而mAb2、多克隆抗体与P120T的反应性降低，其中mAb2与P120T的反应性明显下降。C121S与4种抗体的反应性显著低于野生HBsAg；K122I与4种抗体没有反应性，全部为阴性。T123N与4种抗体没有反应性或微弱的反应性（图2）。将细胞裂解后ELISA检测细胞裂解液中胞内的变异HBsAg与抗体的反应性，结果显示P120T与mAb1、多克隆抗体的反应性和野生HBsAg相似，与mAb2的反应性显著下降。C121S与mAb1、mAb2的反应性明显减弱，与多克隆抗体的反应性明显下降。K122I与多克隆抗体有微弱的反应性，与其他抗体没有反应性；T123N与mAb2的反应性与野生HBsAg比轻度下降，与其他抗体没有反应性（图2）。上清液和细胞裂解液中T123N与mAb1、mAb2和多克隆抗体有反应性，结果显示T123N变异导致HBsAg分泌障碍。
4. 7种HBsAg诊断试剂盒与变异HBsAg的反应性：7种试剂盒检测转染细胞上清液，以S/N值表示变异HBsAg的反应性。从图2可以看到P120T除与KitC反应性明显降低以外，与其他6种有较好的反应性。C121S与KitA的反应性较野生型有中度下降（S/N为15.69±1.90），比其他6种反应性明显下降。K122I与所有7种试剂盒没有反应性，都为阴性。T123N与KitD有较弱的反应性，与其他试剂盒没有反应性。
实验中我们用试剂盒检测了细胞裂解液中HBsAg的反应性。结果显示细胞裂解液中变异HBsAg与7种试剂盒的反应性与上清液一致。C121S和T123N的反应性比上清液有所增高。
5. G145R HBsAg与4种抗体、7种检测试剂盒的反应性：为比较HBsAg MHRII区对维持其抗原性的作用，实验中选择G145R HBsAg同时检测其抗原性。结果显示，抗-HBs145与G145R有很好的反应性，mAb1、mAb2与G145R HBsAg的反应性较差，多克隆抗体与G145R HBsAg的反应性比野生HBsAg有明显降低。在7种HBsAg检测试剂盒中，两种试剂与G145R HBsAg有弱反应性，其余5种与G145R HBsAg的反应性都很差（图2）。
6. 免疫荧光检测单克隆抗体mAb1、mAb2与变异HBsAg的反应性：实验中将转染后的细胞固定在玻片上，免疫荧光检测细胞内抗原与各种抗体的反应性。在野生HBsAg转染细胞内可见大量的胞浆型、颗粒状或融合在一起的阳性着色，阴性对照未着色。用mAb1检测P120T及C121S转染细胞内可见少量的颗粒状阳性着色，用mAb2检测C121S转染细胞内未见阳性着色；两种抗体与K122I转染细胞都没有阳性着色。mAb1检测T123N变异未见阳性着色，而用mAb2检测可见有较好的阳性着色，抗原主要分布在细胞核周围（图3）。
讨 论
乙型肝炎表面抗原“a”决定簇的空间构象是决定其抗原性的关键[3]。针对“a”决定簇的抗体可以中和病毒，具有免疫保护作用。HBsAg“a”决定簇氨基酸的变异可以影响其空间构象，抗原性改变，导致免疫逃避，还可以导致与针对野生株抗体的反应性降低，不能被目前的诊断试剂盒识别，形成漏检[12，13]。最近的研究以及本研究结果表明，“a”决定簇以外区域氨基酸变异也可以影响HBsAg的空间构象和抗原性。Ireland等[10]在肝移植HBV感染者中发现发生在MHRⅡ区的T123N变异可以显著影响HBsAg的抗原性，导致漏检。本研究结果也显示发生在MHRⅡ区的K/R122I变异也可以明显影响HBsAg的抗原性。因此，我们推断MHRⅡ区的4个氨基酸对维持HBsAg的空间构象和抗原性有重要作用。
本研究结果证实MHRⅡ区的4个氨基酸对维持HBSAg空间构象和抗原性有重要作用。ELISA检测结果表明有2种单克隆抗体、多克隆抗体以及6种HBsAg检测试剂盒可以较好识别P120T变异，单克隆抗体mAb2与该变异反应性较差。C121S、T123N变异可以被少数单克隆抗体和试剂盒识别，但反应性较低。K122I和T123N与试剂盒的反应性明显降低。K122I变异不能被任何抗体和试剂盒检测到。这些结果说明MHRⅡ区的4个氨基酸发生的变异影响了HBsAg的抗原性，提示该区4个氨基酸对维持HBSAg空间构象和抗原性有重要作用。为说明MHRⅡ对维持HBsAg抗原性的作用，实验中选择G145R HBsAg同时检测其抗原性，作为“a”决定簇变异的对照；结果表明，G145R变异同样改变了HBsAg的抗原性，导致其抗原反应性下降，多数国产试剂盒和mAb2不能检测到。而且，G145R变异导致新的抗原表位形成，用针对该表位的特异性抗体可以很好的识别该变异。因此，MHRⅡ和“a”决定簇的常见变异G145R对于维持HBsAg的抗原性同样有重要作用。
变异HBsAg与单克隆抗体、多克隆抗体免疫反应性降低的原因是抗原性的改变而不是变异HBsAg表达降低。用Western blot检测转染细胞内表达的各种变异HBsAg在N末端的血凝素标记，各种变异HBsAg表达的量与野生型HBsAg也基本一致，表明各种变异HBsAg在蛋白质表达水平上也没有差别。
HBsAg个别氨基酸变异可以影响抗原分泌[14]。本研究结果显示T123N变异不但影响HBsAg抗原性的改变，还可以导致HBsAg分泌障碍。T123N细胞上清液与3种单克隆抗体的反应性和野生HBsAg相比明显下降。转染细胞裂解液与mAb1和抗-HBs145的反应性很低，但与mAb2和多克隆抗体有较好的反应性。用单克隆抗体mAb2进行免疫荧光的方法检测胞内表达T123N变异HBsAg，胞浆中有阳性着色。结合ELISA检测结果，说明T123N变异不但导致抗原性改变。同时也导致抗原分泌障碍。
参 考 文 献
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