【关键词】 癌，肝细胞； 肝炎病毒，乙型； 基因； 突变； X基因； 前S/S基因
Characteristics of mutations in hepatitis B virus X gene and preS/S gene isolated from patients with HBV-related hepatocellular carcinoma XIANG Guang-ming, ZHONG Sen, ZHAO Chuan, DENG Cun-liang, SHI Xiao-ling, ZHOU Tao-you, TANG Hong.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Hepatitis B virus; Genes; Mutation; X gene; PreS/S gene
【First author’s address】 Department of Infectious Diseases, Guangyuan People's Hospital, Guangyuan 628000, China
Email: geoge972@sina.com
HCC是常见的恶性肿瘤之一。众多流行病学资料显示，慢性HBV感染是HCC的主要病因。HBV感染致HCC的确切机制尚未彻底阐明，有学者认为HBV基因变异与肝癌发生发展密切相关[1]。HBV C区变异与HBeAg血清转换及肝炎活动相关，与HCC发生关系不大[2]。而P基因区变异与抗病毒药物耐药有关[3]。我们选取HBV X及前S/S基因作为研究对象，克隆了9例肝癌伴HBV感染者及其家族中11例HBV感染者血清HBV X及前S/S基因，经测序后对比分析，以了解该区变异是否与肝癌发生发展之间存在相关性。
一、材料与方法
1. 对象：实验组为肝癌伴HBsAg阳性患者9例，均为病理学检查证实；对照组为肝癌患者家族中11例HBsAg阳性不伴肝癌者（所有对象的HBsAg采用ELISA法检测）。留取血清2ml，保存于-70℃冰箱。
2. 主要试剂：PrimeSTARTM HS DNA聚合酶试剂盒、DL2000 DNA标准购自日本TaKaRa大连公司；胶回收试剂盒、pBS-T质粒载体试剂盒、大肠杆菌Top10感受态细胞、质粒小量抽提试剂盒购自北京天为时代公司；平末端DNA片段加A试剂盒购自上海生工生物工程公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、 X-Gal购自美国Amresco公司；限制性核酸内切酶SacⅠ与HindⅢ购自日本TaKaRa大连公司。
3. 引物：参照GenBank中HBV中国株相应保守序列设计，由日本TaKaRa大连公司合成。前S/S基因引物：上游5′-GACGGTACCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAA CCTCGA-3′(nt2848～2874)；下游5′-GGGGCGGCCGCTT AAATGTATACCCAAAGACAAAAGAA-3′(nt835～809)。X基因引物：上游5′-GGAGCTCATCATTTCCATGGC TGCTCGGCTGTG-3′(nt1365～1390)；下游5′-GCGG GATCCATTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGCATG-3′（nt1839～1813）。
4. 血清HBV DNA提取：吸取血清样本200μl，加入1.5ml微量离心管，分别加入200μl TES液（10mmol/L Tris-HCl、pH 8.3、5mmol/L EDTA、0.5%十二烷基硫酸钠）及50μg蛋白酶K，混匀后于42℃温水浴过夜孵化。采用酚-氯仿法提取HBV DNA。
5. PCR扩增目的基因片段：采用热启动方式扩增目的基因，使用PrimeSTARTM HS DNA聚合酶。PCR反应条件：扩增HBV X基因：94℃预变性5min；94℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增HBV前S/S基因：94℃预变性5min；94℃ 45s，52℃ 30s，72℃ 90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。以pHBV4.1作为阳性对照，扩增产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳。
6. PCR产物胶回收：根据胶回收试剂盒说明书操作。
7. PCR产物克隆及鉴定：胶回收PCR产物加A反应后与pBS-T质粒载体连接并转化大肠杆菌Top10感受态细胞，接种到LB固体琼脂平板(含氨苄青霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、X-gal)，过夜培养。次日挑取白色菌落接种于LB液体培养基（含氨苄青霉素100μg/ml），过夜培养后抽提质粒，分别做PCR及酶切鉴定。
8. 测序：将带有重组质粒的菌液交上海生工生物工程公司做序列测定，引物为T3或T7通用测序引物。
9. 序列对比：利用DNAClub分析软件将测得的编码区序列翻译出氨基酸序列，根据HBV S区氨基酸序列差异，对分离的HBV DNA进行基因型及血清型归类[4]。利用BLAST检索，将各序列结果与相应基因型标准株序列对比（B基因型：AF282917、AF291830；C基因型：X04615、AY040627），找出各变异位点。同一位点出现变异超过2株视为变异活跃位点。
10. 统计学分析：用SPSS12.0统计分析软件对两组不同位点变异资料做χ2检验（四格表Fisher确切概率法）。
二、结果
1. HBV X基因及前S/S基因扩增结果：除对照组中1例未能扩增出前S/S基因，仅扩增出S基因外，其余19例样本均扩增出HBV X基因及前S/S基因，见图1，2。将各基因片段克隆至pBS-T载体后以T3或T7通用测序引物作序列测定。
2. 基因型及血清型：肝癌组中1例S基因117位氨基酸移码突变无法准确分型，4例为B基因型，占44.44%；4例为C基因型，占44.44%；两者所占比例差异无统计学意义（P>0.05）。B基因型为adw2血清型，C基因型为adrq+血清型。
3. HBV X基因变异：在肝癌患者中，HBV X基因突变致编码HBx蛋白氨基酸变异，与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
4. HBV前S/S基因变异：在肝癌患者中，HBV前S/S基因点突变与对照组相比，差异没有统计学意义（P>0.05），见表2。肝癌组有4例L蛋白氨基端截断变异，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。但其位点不一致，分别为56～125位及129～142位氨基酸缺失。
三、讨论
HBV基因组的异质性（或多态性）可显著影响病毒-宿主间的相互作用及患者的临床过程，HBV基因变异可能与肝癌发生存在某种联系。
X基因是HBV 4个开放读码框中最小的一个，其编码产物含154个氨基酸，即HBx蛋白。HBx蛋白具有反式激活功能，与肝癌发生的关系密切。本研究在肝癌组发现HBx蛋白的Th淋巴细胞表位116、118、119、127位氨基酸变异，与Hwang等[5]报道一致。在HBx蛋白的反式激活区，主要发现密码子127V→I、129F→L变异，相应的核苷酸变异为核心启动子区（1744～1851nt）1752G→A、1760T→A突变。而核心启动子区1762A→T及1764G→A核苷酸双点突变比例仅11.11％，与文献[6，7]报道的变异率66%及64%相差较大。既往研究发现，羧基端缺失变异的HBx蛋白可能参与肝细胞的恶性转化，与肝癌发生有关[8]。本研究结果未发现删除变异，可能与未检测肝癌组织中整合的HBV有关。我们认为HBV X基因点突变与HCC发生没有关系。
在肝癌患者中，前S1区变异位点在第84及94位密码子，前S2区变异位点在起始密码子及2、6、22位氨基酸，S区变异在129位氨基酸比例高于非肝癌组，这些变异位点多在病毒包膜蛋白的抗体结合域内，与病毒的免疫逃避、持续感染有关[4]。变异株感染导致持续免疫损伤及肝细胞再生，加上HBV基因组的整合，使肝细胞基因组稳定性下降，可能逐步进展为HCC。但我们的研究不支持该区点突变与肝癌发生有关。Hsieh等[9]研究证实前S1区nt3040～3111删除变异以及前S2区nt4～57删除变异伴起始密码子变异的L蛋白可诱导肝细胞氧化性应激及DNA损伤、肝细胞基因组变异,从而促进肝癌发生。本研究结果也显示4株前S基因氨基端删除变异致L蛋白截短具有肝癌特异性，提示该区变异可能与肝癌发生密切相关，但是需要进一步研究证实。有必要对HBV感染者进行S基因变异监测。对发生S基因删除变异的HBV感染者加强HCC筛查有助于HCC的防治。
参 考 文 献
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林旭，徐晓，郑大利，等.肝癌患者乙型肝炎病毒全基因组结构分析.中华肿瘤杂志,2004,26:213-216.
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