【关键词】 抗体，单克隆； 细胞融合；重组新型人角质细胞生长因子变构体 Preparation of monoclonal antibodies against recombinant keratinocyte growth factor variants WU Sheng-xi, CAI Jia-li, FAN Kai. 【Key words】 Antibodies, monoclonal; Cell fusion; Recombinant keratinocyte growth factor variant 【First author抯 address】 Bioengineering College, Chongqing Institute of Technology, Chongqing 400050, China Email: sxwu2004@cqit.edu.cn 角质细胞生长因子（KGF）是皮肤表层的细胞因子，有KGF-Ⅰ和KGF-Ⅱ两种类型[1]，能促进角质细胞增生、保护黏膜细胞和肝细胞。范开等[2]证明经基因工程改造的K102能有效地预防和治疗实验性肝纤维化，并对已形成的肝纤维化有一定的逆转作用。在被动免疫中，重组K102已成功的用于防治纤维化疾病。但重组K102蛋白与抗天然KGF的单克隆抗体无免疫结合反应，而目前国内尚无抗重组K102单克隆抗体研究的报道。为进行重组K102的免疫学研究，包括建立ELISA法测定其体内外药物浓度，进行Western blot以及免疫组织化学实验等。本实验室根据杂交瘤细胞建株的原理，用PEG融合技术，建立分泌抗重组K102蛋白抗体的杂交瘤细胞株。 一、材料与方法 1. 实验材料：重组K102蛋白由重庆富进生物医药有限公司提供；DMEM、无血清培养基、HAT、HT为美国Gibco公司产品；PEG-1500为美国Roche公司产品；酶标二抗（HRP-羊抗小鼠IgG）为华美公司产品；小牛血清由华中理工大学提供；SP2/0骨髓瘤细胞为本实验室保存；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping试剂盒为美国Roche公司产品；BALB/c小鼠及昆明系小鼠购自重庆医科大学。 2. 杂交瘤细胞系的建立：（1）BALB/c小鼠的免疫：将纯化的重组K蛋白（稀释成1mg/ml）与等量福氏完全佐剂充分乳化后腹腔免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠，0.2ml/只；以后每隔3周相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后，同途径免疫2次，融合前3d，用加倍量的不加佐剂的抗原，同途径加强免疫1次。（2）单克隆抗体检测方法的建立：按常规方法建立间接ELISA。通过方阵滴定确定包被抗原，阴性、阳性血清（S-、S+）最佳工作浓度。（3）细胞融合：按参考文献[3]的方法进行。（4）阳性杂交瘤细胞的克隆:采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞。将细胞用完全培养基稀释成10、5、2.5个/ml 3个密度，分装96孔细胞培养板，每孔0.2ml，1周后观察并标记单克隆孔，当单克隆孔长至孔面积的1/3～1/2，检测单克隆孔的细胞上清液。阳性单克隆孔再进行1～2次亚克隆，直至整个细胞培养板的单克隆孔均为阳性为止。 3. 单克隆抗体的生物特性鉴定：（1）腹水的制备及效价测定：按参考文献[3]的方法生产腹水，腹水抗体效价测定采用间接ELISA法。（2）阳性杂交瘤细胞的稳定性试验：杂交瘤细胞继代培养6个月以上，定时用ELISA间接法测定培养上清液抗体效价。分别复苏冻存1、2、4、8个月和12个月的阳性杂交瘤细胞，用ELISA间接法测定细胞培养上清液及细胞诱生小鼠腹水的抗体效价。（3）单克隆抗体的亚型鉴定：按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping试剂盒说明书操作。（4）单克隆抗体腹水的纯化：采用辛酸-硫酸铵法。（5）杂交瘤细胞染色体分析：取对数生长期的杂交瘤细胞，经秋水仙碱、0.075mol/L KCl溶液处理，固定制片后染色，油镜下观察染色体并记数。（6）单克隆抗体特异性鉴定：采用间接ELISA法，分别将提纯的重组K102蛋白、天然KGF以相同的浓度（8μg/ml）包被酶标条来检测阳性杂交瘤细胞上清液特异性。 二、结果 1. 杂交瘤细胞系的建立：（1）最佳抗原包被浓度：8μg/ml；最佳阳性、阴性血清稀释度1∶4000。融合前，免疫小鼠血清抗体的间接ELISA效价为1×105。（2）细胞融合率为80%，间接ELISA阳性率为100%，选择阳性值较高的24个孔亚克隆，经过2次亚克隆，不断反复筛选得到了2株较稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4B4、2A8。 2. 单克隆抗体的生物特性鉴定：（1）阳性杂交瘤细胞稳定性试验：细胞株连续继代培养6个月以上，其培养上清液效价仍保持在1∶512～1∶1024。这些细胞株冻存1、2、4、8个月和12个月后复苏，其诱生腹水的单克隆抗体效价仍保持在1∶5万～1∶10万之间。（2）杂交瘤细胞染色体分析：4B4、2A8两株杂交瘤细胞分裂相染色体形态观察，均可见到端着丝点和中间着丝点，染色体数目介于100～110条之间，具有杂交瘤细胞染色体特征。（3）单克隆抗体特异性鉴定：见表1。用4B4、2G8单克隆抗体细胞上清液经一定稀释后，分别与抗重组K102蛋白、天然KGF包被板进行ELISA，重复3次。结果表明所获得的单克隆抗体与天然KGF间接ELISA反应均为阴性；而与重组K102蛋白反应细胞上清液效价高于1∶512。（4）单克隆抗体亚型鉴定：在试纸条的G1，κ区各出现一条清晰的条带，表明单克隆抗体的亚型属IgG1, κ型。（5）抗重组K102提纯腹水效价：结果表明提纯前4B4腹水单克隆抗体ELISA效价高于1∶5万，提纯后抗体效价仍高于1∶5万。 表1 （略） 注：a 阳性血清：指抗重组K102蛋白的小鼠血清，用于相应抗原包被孔，作为阳性对照（融合前免疫小鼠血清抗体ELISA效价已达1×105），最终判定的单克隆抗体ELISA效价（P/N≥2.1，P为待检样品A450值，N为阴性样品A450值） 三、讨论 本实验用提纯的重组K102蛋白免疫BALB/c小鼠，获得了2株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为4B4、2A8，其腹水ELISA效价高达1∶5万～1∶10万；对4B4、2A8进行一系列的生物学特性鉴定，表明4B4、2A8经反复冻存，复苏多次传代，仍能分泌高效价抗体，特异性针对重组K102蛋白，将为进行重组K102蛋白的免疫学研究奠定重要基础。 参 考 文 献 [1]Finch PW, Rubin JS. Keratinocyte growth factor/fibroblast growth factor 7, a homeostatic factor with therapeutic potential for epithelial protection and repair. Adv Cancer Res, 2004, 91: 69-136. [2]Fan K, Huang HT, Zhang DZ. Study on a recombinant keratinocyte growth factor variant in therating of experimental rat liver fibrosis. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 229-230. 范开,黄洪涛，张大志.重组新型人角质细胞生长因子异构体抗肝纤维化实验研究.中华肝脏病杂志,2005,13:229-230. [3]Liu XF, ed. Applies of monoclonal antibodies on agricultural. Anhui Science and Technology Press, 1994: 21-23, 32-36. 刘秀梵，编.单克隆抗体在农业上的应用.安徽科学技术出版社,1994:21-23,32-36. 《中华肝脏病杂志》版权 |