【关键词】 肝炎病毒，乙型； 抗原，表面； 变异； 抗体，单克隆
The antigenicities of 15 expressed hepatitis B surface antigen variants TIAN Yong-jun, ZHANG Zhen-hua, QIN Li, LIU Shen-pei, GONG Jin-song, ZHANG Zheng-mao, LU Meng-ji, YANG Dong-liang.
【Key words】 Hepatitis B virus; Antigens, surface; Variation; Antibodies, monoclonal
【First author's address】 Research Center of Medicine, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Corresponding author: YANG Dong-liang, Email: dlyang@ tjh.tjmu.edu.cn, Division of Clinical Immunology, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China HBV s基因突变可引起HBsAg氨基酸变异，并导致抗原性改变[1]。流行病学研究表明其最常见的变异位点是Gly145Arg[2]。此位点的变异株可以逃避乙型肝炎疫苗的免疫预防，而且用目前针对野生株“a”决定簇的单克隆抗体制备的诊断试剂不能测及[3]，造成漏检。我们选8种HBsAg诊断试剂及5种华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室制备的抗-HBs单克隆抗体检测15种HBsAg变异体的抗原性，了解不同变异体对其抗原性的影响。
一、 材料与方法
1. 重组HBsAg的表达：18个表达野生型及变异HBsAg的重组质粒的基本资料见表1。应用脂质体介导插入含HBV s基因的重组质粒，转染Hela细胞。转染72h后，收集细胞培养上清液和细胞，制备细胞裂解液。
2. 8种国产HBsAg检测试剂盒及Abbott HBsAg诊断试剂检测HBsAg的反应性：同时用ARCHITECT HBsAg诊断试剂盒（德国Abbott公司产品）和8种国产HBsAg诊断试剂盒（以字母A、B、C、D、E、F、G和H表示）检测转染细胞上清液中HBsAg的反应性，实验操作按试剂盒说明书进行。以其与相同血清型野生型的S/N值相比得到的百分数来表示其反应性。
3. 抗-HBs单克隆抗体检测变异HBsAg的免疫反应性：TYJ1～TYJ5为华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室制备的5种抗HBsAg的单克隆抗体，识别“a”决定簇形成的构象型表位，且识别的表位不同（资料见另文）；抗-HBs 145单克隆抗体（德国ESSEN大学病毒研究所赠送）为特异识别G145R变异的单克隆抗体[4]。6种单克隆抗体分别以1μg/ml的浓度包被，其余步骤同方法2。首先选中国药品生物制品检定所的HBsAg参考品进行检测，了解方法的可靠性。再检测转染细胞上清液，以变异体样品检测的S/N值与相同血清型野生型HBsAg的S/N值相比的百分数来表示其反应性。
二、结果
1. 变异HBsAg与市售检测试剂的反应性：除BA3.2以外的14种变异HBsAg均可以被Abbott公司 ARCHITECT HBsAg试剂盒检测出。7种变异抗原（1056sp、SA7、91-4696、AP3.1、SA6、HK188和C126）都可以被国产8种检测试剂盒检测到，而且部分试剂盒与HK188的反应性比野生型的强。Arg145yw与A和E、Arg145dw与A、D和E、Arg145dr与A、C、D和E有弱反应性。1056sp可被8种检测试剂盒检出，但反应性只有野生型的10%～30%。BA2.4不能被C和D试剂盒检出，而且与其他试剂反应性较弱。8种试剂盒检测BA3.4和 BA3.2均为阴性（表2）。用8种试剂盒检测转染BA3.2细胞裂解液中的HBsAg全为阴性。
2. 变异HBsAg与5种单克隆抗体的反应性：用国家HBsAg参考品检定实验条件，阴性参考品检测结果未出现假阳性；阳性参考品检测未出现假阴性。单克隆抗体TYJ4可以检测出除BA3.2以外的14种变异HBsAg（表3）。TYJ1、TYJ2和TYJ3可以检测15种变异HBsAg中的13种，且三种抗体与变异HBsAg的反应模式也不一样。TYJ2与变异HBsAg的反应性可以达到野生型的30%～100%。TYJ5与Arg145yw、BA3.2、M5、Arg145dw和Arg145dr反应性明显下降，与其他变异HBsAg的反应性为野生型的9%～140%。5种单克隆抗体均可以检测出细胞裂解液BA3.2变异HBsAg，但反应性只有野生型的20%～30%。针对G145R位点的特异性抗体与三种G145R变异HBsAg都有很强的反应性，但和三种血清型的野生型HBsAg没有反应（表3）。
三、讨论
本实验结果显示，发生在“a”决定簇的多数变异对抗原反应性影响不大，不会导致所用诊断试剂的漏检。然而发生在120～124位氨基酸的变异（1056sp、BA3.4、BA2.4、M5和BA3.2），以及145位氨基酸的变异（Arg145），无论是单独发生还是伴随其它区的变异同时发生，都可导致变异抗原反应性的降低或消失。BA3.4和BA3.2都存在T123N的变异，但BA3.2同时还存在C124R变异，对BA3.4和BA3.2转染细胞上清液和细胞裂解液的检测结果说明，T123N变异影响HBsAg的抗原性，C124R变异导致抗原分泌障碍[3]。ay血清亚型发生的变异较ad血清亚型的变异更难检出。这可能是由于实验中使用的抗体均是由ad亚型HBsAg免疫而得，对ad亚型表面抗原有较好的亲和力。目前我国在临床诊断中使用的HBsAg检测试剂盒检测变异株的能力不同。本实验中的15种变异体，各试剂盒分别有3～9种不能检出，因此有必要提高检测变异株的能力，减少漏检。本研究室筛选出的4种抗体可以较好检出除BA3.2以外的14种变异HBsAg。如用来改进目前国内使用的HBsAg检测试剂盒，将有一定的应用价值。
参 考 文 献
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[2]Xu HM, Peng ML, Ling N, et al. PreS/S gene mutations in HBV in children infected through mother-to-infant transmission and in their mothers. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2003, 11: 398-401.
许红梅,彭明利,凌宁，等.母婴传播后母子体内乙型肝炎病毒前S/S基因变异研究.中华肝脏病杂志,2003,11:398-401.
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[4]Zheng X, Weinberger KM, Gehrke R, et al. Mutant hepatitis B virus surface antigens (HBsAg) are immunogenic but may have a changed specificity. Virology, 2004, 329: 454-464. 《中华肝脏病杂志》版权 |
