【关键词】 肝纤维化； 肝星状细胞； 细胞凋亡
Effect of blocking Wnt/β-catenin signaling pathway on apoptosis of activated hepatic stellate cells WENG Zhi-hong, LEI Yan-chang, PENG Cheng, ZHANG Shu-ling.
【Key words】 Liver fibrosis; Hepatic stellate cell; Apoptosis
【First author's address】 Department of Infectious Diseases, Xiehe Hospital, Tongji Medical College, Huazhong Science and Technology University, Wuhan 430022, China
Corresponding author: ZHANG Shu-ling, Email: baihuasheshecao@ yahoo.com.cn HSC的活化是肝纤维化的中心环节[1，2]，参与HSC活化的多种因素如生长因子、细胞因子、氧化应激产物等，需通过HSC细胞内的信号转导才能发挥作用。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长、增殖和凋亡的关键通路，在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用[3]。近年来发现该信号通路与肺及肾纤维化的形成密切相关[4，5]，但该信号途径与肝纤维化的关系尚不明确。本研究旨在探讨阻断Wnt/β-catenin信号对活化HSC凋亡的影响，明确该信号通路在肝纤维化中所起的作用，寻求抗肝纤维化治疗的新途径。
一、材料与方法
1. 材料：大鼠肝星状细胞株HSC-T6由上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠；β-catenin单克隆抗体, caspase-3多克隆抗体均为美国Santa Cruz公司产品，Annexin-V FITC/PI试剂盒（深圳晶美公司）；Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司），双荧光素酶报告系统试剂盒（美国Promega公司），荧光素酶报告质粒pTOPFLASH和pFOPFLASH为Dietmar Gradl教授惠赠，T淋巴细胞因子（TCF）的显负性突变体表达质粒pcDNA-dnTCF-HA由Sheng Hong-miao教授惠赠，海肾荧光素酶载体pRL-SV40为Vladimir Korinek教授惠赠。
2. HSC培养：用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基37℃、5% CO2条件下培养。
3. 免疫细胞化学法检测β-catenin的表达：取HSC-T6细胞以2×105/ml接种于6孔板制备细胞爬片。PBS洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定30min，加0.3% TritonX-100 20min，PBS洗后加β-catenin单克隆抗体，4℃过夜，吸去抗体，加羊抗鼠第二抗体室温孵育1h，PBS洗后加入ABC复合物，室温孵育1h，PBS洗后加DAB溶液显色，拍照。
4. 双荧光素酶报告系统检测β-catenin/TCF转录活性：以pTOPFLASH为报告质粒，pFOPFLASH为阴性对照。用Lipofectamine2000转染，以pRL-SV40作内对照。转染前1d将细胞接种入24孔板中，A组每孔转0.5μg TOPFLASH和0.1μg pRL-SV40或0.5μg FOPFLASH和0.1μg pRL-SV40；B组每孔1.0μg TOPFLASH和0.1μg pRL-SV40或1.0μg FOPFLASH和0.1μg pRL-SV40，每个剂量组各设3个复孔。转染24h后立即用荧光检测仪作荧光定量测定。
5. 阻断Wnt/β-catenin通路对HSC-T6凋亡的影响: （1）Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测HSC凋亡：HSC-T6接种于6孔板，用Lipofectamine2000每孔转染1.0μg pcDNA-dnTCF-HA，对照组转染1.0μg pcDNA空质粒。48h后收集细胞，按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明进行染色，用流式细胞仪检测HSC的凋亡率。（2）Western blot检测caspase-3的活性：收集转染pcDNA-dnTCF-HA或pcDNA空质粒48h后的细胞，提取细胞总蛋白，取30μg总蛋白，15% SDS-PAGE电泳分离，转膜，脱脂奶粉封闭后分别加第一、二抗体孵育，增强化学发光法显色拍照，条带进行图像分析，灰度值代表蛋白质的表达量。
6. 统计学处理：数据用x-±s表示，采用SPSS10.0软件分析，P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1. β-catenin在HSC-T6细胞内的表达: 免疫细胞化学染色显示HSC-T6的胞核内有β-catenin强阳性表达，而胞膜及胞浆内β-catenin的表达较弱。
2. β-catenin/TCF转录活性: 双荧光素酶报告系统联合荧光定量测定显示（图1）：转染相同量的质粒时，pTOPFLASH组细胞荧光活性明显高于pFOPFLASH对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。
3. Annexin V-FITC/PI双染色FACS检测HSC凋亡: FACS检测显示转染组细胞早期凋亡率为16.5%, 对照组为4.7%, 差异有统计学意义（P<0.05)。
4. 转染pcDNA-dnTCF-HA的HSC-T6细胞中caspase-3活性的检测：Western nlot检测显示，转染组和对照组细胞均可见caspase-3酶原的表达，转染组细胞还可见活化的caspase-3大亚基（相对分子质量1.7×104）的表达，对照组则无（图2）。
三、讨论
Wnt/β-catenin信号是一个高度保守的信号通路，是调控细胞生长、增殖和凋亡的关键途径。当经典的Wnt信号通路被激活后，分泌到细胞外的Wnt蛋白与跨膜受体Lrp5/Lrp6以及Frizzled结合形成复合物，通过Dishevelled 蛋白传递信号来抑制GSK-3β激酶的活性, 使β-catenin降解复合体失活, 结果β-catenin在细胞质内的降解停止，大量蓄积进入核内, 与转录因子TCF结合，启动下游靶基因的转录和表达，控制胚胎发育及细胞生长、分化等过程[3]。当β-catenin在细胞核内聚集时，可作为该信号通路激活的标志[6]。正常组织细胞中没有Wnt 信号，胞浆内仅有少量游离态的β-catenin，体内绝大多数β-catenin在细胞膜上与E-cadherin 结合在一起，在细胞间黏附过程中发挥作用[7]。
近年来，Wnt/β-catenin通路与细胞凋亡的关系引起学者关注。Almeida等[8]用Wnt3a表达质粒转染成骨细胞OB-6，过激活Wnt/β-catenin信号通路可明显抑制无血清培养诱导OB-6的凋亡效应。Chen等[9]发现转染后稳定表达Wnt-1的大鼠成纤维细胞株Rat-1可显著抵抗长春新碱诱导的凋亡效应，这种抗凋亡作用与Wnt/β-catenin/TCF信号通路的激活密切相关，而阻断该通路可诱导Rat-1细胞凋亡的发生。
本研究结果显示，表型活化的HSC-T6细胞膜和胞浆内有β-catenin的表达，同时细胞核内也有β-catenin的表达。用带核转录因子TCF的结合位点的荧光素酶报告质粒pTOPFLASH及其突变体pFOPFLASH（阴性对照）分别转染HSC-T6, 同时共转染海肾荧光素酶载体pRL-SV40作内对照，通过检测荧光素酶活性反映β-catenin/TCF介导的启动子转录活性[10]，结果发现转染pTOPFLASH组的荧光素酶活性明显高于对照组，差异有统计学意义，提示HSC-T6细胞内有β-catenin/TCF介导的核转录，表明活化的HSC内存在功能激活的Wnt/β-catenin/TCF信号转导通路。
肝纤维化在一定情况下可被逆转，HSC活化后其表型很难逆转，通过细胞凋亡使HSC 数量减少可能是肝纤维化逆转的机制。本研究结果显示，用核转录因子TCF的显负性突变体dnTCF（缺乏生物学活性功能的TCF，能特异性的抑制β-catenin/TCF介导的核转录[11]）表达质粒转染HSC-T6细胞，阻断Wnt/β-catenin信号通路，Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测显示转染组的细胞凋亡率明显高于对照组；同时Western blot检测显示，转染组有活化的caspase-3大亚基片段表达，对照组则无。提示阻断Wnt/β-catenin信号通路后，活化的HSC凋亡增加，其机制可能与caspase-3的激活有关。Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞质和胞核底物，最终导致细胞凋亡。
HSC凋亡能够减少活化的HSC的数量，减少ECM成分产生，促进ECM的降解，达到阻止肝纤维化的形成、进展甚至逆转肝纤维化的目的。本研究结果表明，Wnt/β-catenin信号通路可能通过调控活化的HSC的凋亡在肝纤维化中起重要作用。与细胞凋亡相关的通路很多, Wnt/β-catenin信号与其他信号通路或细胞因子的关系, 及阻断该信号通路后以何种机制调控下游因子加速细胞凋亡, 还需进一步研究，以期为肝纤维化治疗提供新途径。
参 考 文 献
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