数以百万计的慢性乙型肝炎患者接受了拉米夫定抗病毒治疗，并取得较好的疗效。但随着用药时间的延长，HBV对拉米夫定的耐药明显增加。临床上，常出现ALT、HBVDNA反跳，部分病人病情急剧加重，甚至出现并发症而死亡。仅是HBVP基因变异所致，还是HBV许多基因变异共同的结果？为此，我们对服用拉米夫定最终发生严重肝功能损害的4例慢性乙型肝炎患者进行相关HBV基因进行分析。
材料与方法
一、实验材料
(一) 病例选择：4例慢性乙型肝炎患者均为我院就诊者，编号分别为12、14、18、20，诊断符合2000年病毒性肝炎诊断标准,其中男性3名、女性1名，平均年龄44岁。4名患者服药时期从1998年至2004年；服药时间最长5年，最短8个月，平均2.1年；该4例患者最终均以慢性重度和重型乙型肝炎诊断入院，其中12、20号患者发生慢性重型肝炎死亡，14、18号患者以慢性重度乙型肝炎好转出院，其入院时HBVNDA定量分别为：4.5×105copies/mL、5.9×107copies/mL、3.4×108copies/mL、2.7×106copies/mL。
二、实验方法：
(一) 血清HBV DNA 提取100 μL血清加TES (10 mmoL/L, TrisHCl, pH 8.0, 5 mmoL/L EDTA , 0.5% SDS, 150 μg/m l 蛋白酶K) , 65℃ 3小时,常规酚/氯仿提取,乙醇沉淀,DNA 溶解于20 μL双蒸水中。
(二) HBV基因组扩增和克隆参照何建文等［1］的方法，把HBV分两个片段扩增。
(三) 序列比对把测序DNA序列及翻译后的相应蛋白序列应用美国NCBI服务器中的BLAST进行比对，找出用药前后变异的序列。
(四) 血清型分析以BioEdit软件分析HBsAg81～180AA之间的序列，首先根据S抗原122AA、160AA判定为adr或adw,再以127AA判断w1～w4,以159AA及177AA判断是否为adrq［2］。
结果
一、PCR结果
从4例病例中成功扩增出用药前后共8份血样长度分别为2.05KB和1.15KB的条带（图1略）。
二、基因型及血清型分析
4例病例治疗前后均未发生基因型和血清型的改变，12号为B基因型/ adw2，14号为B基因型/ adrq+、18号为B基因型/adw2，20号为C基因型/adw2。
三、治疗前后HBV碱基变异率
死亡病例12、20号的HBV碱基变异率分别为7.93%和7.52%，好转病例14、18号的HBV碱基变异率则分别为5.83%和6.11%。
四、治疗前后HBV各编码区氨基酸变异分析
PreS及S区氨基酸变异：在PreS1区，存在两处突变热点，即：K35R和L45F，上述位点为T细胞表位（AA21～47），在PreS2区，12号病例HBV在起始氨基酸发生变异，导致M蛋白的缺失，此外，还发现多处HBV变热点，如S33N、A35G、Q36P、N37T、V39A和A41P等，均处于T细胞表位内（AA29～48），其中第36位氨基酸性质由亲水性变成疏水性（谷氨酰胺→脯氨酸），可能对T细胞表位影响最有意义。在S区，有两处氨基酸变异热点（T126I、T143S）发生于S 蛋白а决定簇AA124～147内，此外，14号病例治疗前后第161位氨基酸发生变异，由亲水性酪氨酸变成疏水性苯丙氨酸。
PreC及C区氨基酸变异:20号病例治疗前后HBV在PreC的第28位色氨酸发生终止突变,造成e抗原阴性.C区共发生5处氨基酸变异(P5H、S87G、P135Q、P151Q、P156S)，主要位于B细胞表位（AA76～89、AA130～135、AA146～159）内。
P区氨基酸变异：P基因区变异的21氨基酸分别分布于末端蛋白区（8个）、间隔区（5个）、聚合酶区（8个），RNA酶区未发生变异。聚合酶区变异的8个氨基酸中，只有两个位于B区内，即R513P、L526M，与拉米夫定耐药性有关。其他六个变异位点均不在聚合酶区的5个保守区（A～E）内，但其中第346、473和477位的氨基酸变异均引起氨基酸性质的改变。
讨论
长期应用拉米夫定容易诱发HBV P基因发生点突变，其中备受关注的是该区的YMDD，这种变异均导致了拉米夫定与多聚酶亲和力的下降［2］。临床上出现肝功能恶化、HBVDNA重新复制。有报道40.6%的病人出现病情加重，甚至死亡［3］。我院也有不少类似病例发生，为此，我们分析了4例肝功能严重恶化的患者服药前后HBV基因变异情况。本研究的结果显示，4例由于服用拉米夫定而致慢性重型肝炎的患者，其聚合酶区均未发生YMDD变异，但同时我们观察到，死亡病例（12号、20号）治疗前后在B区内均有氨基酸变异，而好转病例(14号、18号)则没有，推测B区内氨基酸变异可能与肝炎的重症化有关。聚合酶区的其他氨基酸变异（6个）、末端蛋白区（8个）及间隔区（5个）氨基酸变异与病情的关系不清，有待于进一步研究。
我们观察到，除P区基因突变外，4例患者治疗前后均有多处点突变，主要分布于PreS1、PreS2、S和C区已知T细胞表位和B细胞表位，由于这些已知的细胞表位与宿主的免疫应答密切相关，所以这些区段的氨基酸变异可能与病情加重有关。
本研究表明，4例患者治疗前后HBV在PreS1区的T细胞表位内均发生了K35R和L45F，但其HBV含量均较高，提示导致针对PreS1的特异性B细胞免疫不能产生足够的中和性抗体或降低PreS1、S特异性中和性抗体产生，从而影响病毒的清除。
本研究结果显示，4例患者均在PreS2区内存在6个变异位点，分别为：S33N、A35G、Q36P、N37T、V39A和A41P，其中第35位、第36位变异氨基酸发生了性质的改变。Pollicino等［4］报道了5例既往无肝病史的暴发性肝炎患者中都存在PreS2起始密码子的变异，而对照的13例急性肝炎患者中却没有这样的变异，表明PreS2起始密码子变异与重型肝炎有关。本研究中12号死亡病例治疗前后HBV发生了PreS2起始密码子变异，说明这此变异与慢性重型肝炎的发生有关。
我们研究结果显示，死亡病例（12号、20号）治疗前后在第87、151位内均有氨基酸变异，而好转病例(14号、18号)则没有，推测此两处氨基酸变异可能与病情的重症化有关。我们的4例患者中，只有1例慢性重型肝炎（20号）发生了Pre C区W28→Stop变异，支持上述观点。
本研究表明服用拉米夫定后发生的病情加重不一定与YMDD变异有关，更有可能是HBV多个变异位点综合作用的结果，尤其是各个编码区上的T、B细胞表位变异可能在此过程中起着重要作用。此外，我们还发现，服用拉米夫定后发生重型肝炎可能与HBV聚合酶区域内B区氨基酸变异、PreS2起始密码子变异、C区第87、151位氨基酸变异和Pre C区W28→Stop变异有关。不过由于本研究样本很小，其结果可能存在局限性。
参考文献
1Blitz L, Pujol FH, Swenson PD, et al.Antigenic diversity of hepatitis B virus strains of genotype F in Amerindians and other population groups from Venezuela.［J］Clin Microbiol. 1998,Mar,36(3)∶648-651.
2Liaw YF.The current management of HBV drug resistance［J］. Clin Virol. 2005 Dec,34 Suppl 1∶S143-146.
3Chen JY, Wang LW, Sun XM, et al.Effects of HBV gene variations on disease development and antiviral therapy for patients with chronic hepatitis B［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2005 Aug,4(3)∶393-397.
4Pollicino T, Zanetti AR, Cacciola I, et al.PreS2 defective hepatitis B virus infection in patients with fulminant hepatitis［J］.Hepatology. 997 Aug;26(2)∶495-499.
上海《肝脏》杂志社版权 |
