神经胶质成熟因子β对肝星状细胞活化和肝纤维化的影响

【摘要】  目的  了解IFNβ-1a抑制肝星状细胞活化新的作用分子，并进一步验证该分子与HSC活化和肝纤维化的关系。 方法  LX-2细胞经2000U/ml IFNβ-1a处理48h后，采用二维电泳技术对IFNβ-1a处理和未处理的LX-2细胞蛋白质进行分离，质谱鉴定IFNβ-1a处理前后LX-2细胞中差异表达超过2倍的蛋白点。对于鉴定出的差异表达分子，通过Western blot和RT-PCR方法验证其在LX-2细胞中、肝组织中以及肺、脑、脾、肾、心组织中的表达情况。 结果  与对照组相比，IFN-β-1a处理组LX-2细胞中有31个差异蛋白点，其中1个特异表达、5个上调表达、25个下调表达。其中特异表达的蛋白经鉴定为神经胶质成熟因子β（GMFβ）；表达上调的5个点鉴定出2种蛋白，为组蛋白H2A和β-原肌球蛋白；表达下调的25个点鉴定出18种蛋白。进一步对GMFβ的表达情况进行验证发现，与对照组相比，经IFNβ-1a作用后的LX-2的GMFβ蛋白表达明显（t＝1.81，P<0.01）；大鼠正常肝组织中GMFβ的蛋白和mRNA相对表达量明显高于肝硬化肝组织（蛋白相对表达量为1.81对比0.10，mRNA相对表达量为0.85对比0.12，t值分别为2.53，2.13，P<0.01）；GMFβ的蛋白和mRNA在大鼠的脑、脾、肝、肾组织中明显表达，而肺、心组织中无表达（t值分别为1.91、1.94，P<0.01）。 结论  IFNβ-1a处理后的LX-2的蛋白质表达存在差异，这些差异表达的蛋白质可能参与了IFNβ-1a对HSC活化的抑制以及HSC的凋亡。IFNβ-1a处理后的LX-2以及正常大鼠的肝组织中GMFβ有明显的表达，GMFβ可能抑制HSC的活化以及抑制肝纤维化的进展。

【关键词】  肝纤维化； 蛋白质组； 干扰素β； 神经胶质成熟因子-β;  肝星状细胞

 

Effect of glia maturation factor beta on the activation of hepatic stellate cells and on liver fibrosis  RAO Hui-ying, WANG Jiang-hua, LIU Feng, FEI Ran, LIU Zhi-da, WEI Lai.  Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing 100044, China

Corresponding author: WEI Lai, Email: weelai@ 163.com

【Abstract】    Objectives    To further study the mechanism of the inhibitory effect of interferon b -1a (IFNb-1a) on the activation of human hepatic stellate cell (HSC) LX-2, and to analyze the differences on the protein expression in LX-2 induced by I IFNb -1a. Methods    Cultured LX-2 cells were treated with 2000 U/ml IFNb -1a for 48 h. Two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) was performed to compare protein patterns of the control (untreated) and IFNb -1a treated LX-2 and for quantitative and qualitative analyses of protein expression. A rat liver fibrosis model was established and the rats were sacrificed and their various tissues were obtained for the same analyses. Western blotting and RT-PCR were used to validate the expression of the changed proteins after treatment of IFNb-1a in LX-2 cells and of various tissues of the rats. Results    70825 spots were detected in control LX-2 cells and 80432 spots in IFNb -1a-treated LX-2 cells. A match rate of 73%-82% was achieved. The results also showed that 31 protein spots displayed quantitative changes in expression after IFNb-1a treatment. Of the 31 spots, 21 proteins were identified, of which, one was newly found, two were enhanced in abundance and 18 showed lower expressions. The newly found protein was glia maturation factor beta (GMFb). The treatment of LX-2 with IFN b-1a increased the production of GMFb protein in comparison with the untreated cells (t = 1.81, P < 0.01). The expression of GMFb protein (1.81 vs 0.10) and mRNA (0.85 vs 0.12) were more in the normal liver tissues than in the cirrhotic liver tissues (t = 2.53, 2.13 respectively, P < 0.01). The expressions of GMFb protein and mRNA were weak in rat heart and lung tissues, however, they were strong in rat liver, kidney, spleen and brain tissues (t = 1.91, 1.94 respectively, P < 0.01). Conclusion There is a significant difference of protein expression levels between IFNb-1a untreated and treated LX-2 cells. These proteins, especially GMFb, may be involved in an inhibition process of IFNb-1a on activation and apoptosis of LX-2 cells. This proteome study may be useful in further studies of the relationship of IFN-1a treatment and human liver diseases.

【Key words】     Liver fibrosis;    Proteome;    Interferon-beta;    Glia maturation factor beta;    Hepatic stellate cells

HSC的激活是肝纤维化发生发展过程中的关键环节，是多种细胞因子的旁分泌和自分泌协同作用的结果[1]。IFNα、β不仅有抗肝炎病毒的作用，还有直接的抗肝纤维化的作用[2，3]。我们应用高信息通量的蛋白质组学技术，观察IFNβ-1a处理前后LX-2细胞蛋白质表达谱的变化，并对差异表达的蛋白质进行分析和验证，主要是神经胶质成熟因子β（glia maturation factor beta, GMFβ），为进一步阐明HSC活化和肝纤维化的机制提供理论和实验依据。

材料与方法

1. 细胞系：人HSC系LX-2由美国Friedman SL教授和上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠[4]。

2. 主要试剂：IFNβ-1a由瑞士雪兰诺公司惠赠，DMEM培养基以及胎牛血清购自美国Hyclone公司。固相pH梯度干胶条（IPG strip pH4-7L, 24cm）、IPG缓冲液、覆盖液均购自美国Pharmacia公司；二硫苏糖醇（DTT）、硫脲、碘乙酰胺、铁氰化钾、TPCK处理的胰蛋白酶、CCA，三氟乙酸、考马斯亮蓝染色剂、蛋白质定量试剂盒均购自美国Bio-Rad公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、甘氨酸、Tris碱、CHAPS、SDS均购自美国Sigma公司。化学试剂均为分析纯级。溶液均用Mili-Q水（电导<1μS）配制。IPGphor等电聚焦电泳仪、ProteanⅡ垂直板电泳槽购自美国Pharmacia公司，PDQUEST 2-DE图像分析软件购自美国Bio-Rad公司。TL-100 Tabletop Ultracentrifuge购自美国Palo Alto公司，Applied Biosystem Voyager-DETM STR Bio-spectrometryTM Workstation System 4307 MALDI-TOF-MS质谱仪购自美国ABI公司。兔抗β-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，小鼠抗GMFβ单克隆抗体购自美国R&D公司，IgG-HRP羊抗兔、兔抗小鼠第二抗体购自美国Santa Cruz公司。

3. LX-2细胞的培养：按文献[4]的方法培养LX-2细胞，于37℃、饱和湿度、体积分数5% CO2条件下，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。分为对照组和IFNβ-1a处理组，处理组于细胞贴壁生长后加入2000U/ml IFNβ-1a后培养48h。我们前期实验已经发现2000U/ml IFNβ-1a作用48h能有效抑制LX-2的活化并且无明显细胞毒性。

4. 蛋白质的提取：胰酶消化收集细胞，细胞沉淀中加入5倍体积细胞裂解液，液氮中反复冻融3次。加入50μg/ml RNase A及200μg/ml DNaseⅠ，静置15min后15000r/min 4℃离心60min。上清液即为细胞总蛋白，RC DC Protein Assay试剂盒测定蛋白质浓度。

5. 二维电泳：将蛋白样品（上样量为1500μg）加入EP管（含水化液）中，振荡混匀，然后开始上样。将含蛋白的水化液（450μl）均匀加入电泳槽，撕开胶条上的保护层，以胶面向下的方式放入胶条，避免产生气泡，添加覆盖液。在不同电压下依次进行电泳：40V，10h；150V，6h；1000V，1h；8000V，1h线性；8000V，20h。电泳结束, 取出胶条, 冲洗并于DTT平衡液中平衡, 同时配制聚丙烯酰胺凝胶。将胶条小心地放置于电泳槽两玻璃之间的SDS-PAGE胶面上，正极在左边，加琼脂糖封胶液固定并排除气泡。先20mA/Gel电泳20min，然后再40mA/Gel电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。取出凝胶在固定液（甲醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶5）中过夜，然后考马斯亮蓝染液染色2h，脱色液（甲醇∶冰醋酸∶水=0.5∶0.7∶8.8）脱色至胶无色。

6. 凝胶图像分析：凝胶通过Umax2100XL扫描仪以及Magicscan扫描软件进行扫描获取图像。然后利用PDQUEST 2-DE分析软件对LX-2细胞蛋白质的双向电泳凝胶图像依次进检测，分析IFNβ-1a未处理组和处理组表达差异超过2倍的蛋白点。

7. 质谱及生物信息学分析：从凝胶中切取差异蛋白点，转入Eppendorf管。每管加1ml脱色工作液（100mmol/L碳酸氢铵＋50%乙腈）室温下脱色至胶粒无色。每管加入100μl乙腈进行脱水并彻底风干。干燥的胶粒用含50ng胰酶的消化缓冲液（50mmol/L碳酸氢铵）2μl重新水化。30min或待胶粒充分吸收溶液后，加入20μl消化缓冲液使之完全没过胶粒。37℃消化10h。反应液转移至洁净的Eppendorf管中。胶粒另用100μl 0.5% TFA/50%乙腈超声30min抽提2次，抽提液合并至反应液中。抽提液真空干燥。样品溶于0.1%甲酸/2%乙腈中，于180μm×10cm BioBasic C18色谱柱上样，按照有机相（乙腈/0.1%甲酸）比例从10%到30%的梯度进行洗脱。毛细管电压为22V。对电荷数为2、3和4，质荷比从400到1800的片段进行串联质谱分析。根据SEQUEST软件的算法对MS/MS谱图在数据库中进行匹配。

8. 大鼠肝纤维化模型构建：雌性SD大鼠3只，体重（150±10）g，SPF级，由军事医学科学院动物中心提供。肝硬化组大鼠3只，首剂50%的CCl4/橄榄油灌胃，5ml/kg，然后改为25%的CCl4/橄榄油灌胃，用量3ml/kg，每周2次。8周后，处死3只大鼠，行肝脏组织病理学检查，证实肝硬化形成。

9. Western blot法检测：提取LX-2各组细胞（对照组和IFNβ-1a 1000、2000、4000U/ml分别处理24、48h组）和大鼠组织（正常大鼠肺、脑、脾、肝、肾、心组织和肝硬化大鼠肝组织）中总蛋白，利用BCA protein Assay Kit进行总蛋白定量，取40μg总蛋白30%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭后分别加入1∶200～1∶400的GMFβ和β-actin蛋白一抗、1∶1000～1∶2000二抗孵育，ECL发光试剂显色后摄像，条带使用Quantity One软件进行图像分析，测定灰度值，用GMFβ蛋白表达的灰度值/β-actin的灰度值来表示蛋白的相对表达量。

10. RT-PCR法检测：按说明用TRIzol Reagent提取正常大鼠肺、脑、脾、肝、肾、心组织和肝硬化大鼠肝组织总RNA，用紫外分光光度计测RNA浓度后，以2μg细胞总RNA为模板，用Oligo dT及随机引物为引物，在SuperscriptⅡ反转录酶作用下，42℃反转录50min，取1μl反转录产物为模板进行PCR，反应条件为：94℃预变性4min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，72℃延伸7min，30个循环。GMFβ引物正向5′-GTGAGTCCTTGGTGG TTTGTG-3′，反向5′-CAGTCAGGTCTTCGGT GTTTC-3′；β-actin引物正向5′-GGCATCGTG ATGGACTCCG-3′，反向5′-GCTGGAAGGTGGA CAGCGA-3′。产物条带用Quantity One软件进行图像分析，测定灰度值，用GMFβ mRNA表达的灰度值/β-actin的灰度值来表示mRNA的相对表达量。

11. 统计学方法：采用SPSS11.0统计软件，实验结果用均数±标准差表示，进行t检验。

结    果

1. 双向凝胶电泳结果：在重复实验条件下，对蛋白样品进行3次双向电泳，对照组和IFNβ-1a处理组的3次凝胶的平均蛋白质点数分别为708±25和804±32，将对照组的胶设定为参考胶，进行3块凝胶之间的匹配分析得到平均匹配率分别为73%～82%（图1）。进一步的重复性分析发现，对照组和IFNβ-1a处理组3块胶中的蛋白质点在其位置上均有较好的重复性。选择同组3块胶图谱中都出现相同变化的蛋白点，并且IFNβ-1a处理组中蛋白质点表达量较对照组中蛋白质点表达量变化超过2倍的，被认为是差异蛋白质点。与对照组相比，IFNβ-1a处理组LX-2细胞中有差异蛋白点31个，其中有新出现的1个、表达上调的5个、表达下调的25个蛋白点。

2. EIS-MS/MS质谱鉴定结果：在对照组和IFNβ-1a处理组二维电泳图谱中，选取有差异表达的蛋白斑点31个，经切割、脱色、还原、烷基化、胰酶酶解、萃取后，进行EIS-MS/MS分析，以基质峰和酶自动降解峰进行校正，得到蛋白质点的肽质量指纹图（PMF），31个点共获取20张PMF。应用PMF数据, 通过软件搜索NCB Inr数据库，进行蛋白质点的肽质量指纹谱与蛋白质数据库的比较来鉴定蛋白质，其中以Mowse分值为基础的概率评价数据库搜寻结果的质量，分值大小表示鉴定蛋白属于随机匹配的可能性，分值大于63表明具有显著性意义。本研究中所分析的31个点共鉴定出20个蛋白质。其中新出现的蛋白为GMFβ；表达上调的5个点鉴定出2种蛋白，为组蛋白H2A和β-原肌球蛋白；表达下调的25个点鉴定出17种蛋白。IFNβ-1a处理后下调的17种蛋白中，细胞骨架蛋白2种，细胞骨架调节蛋白2种，热休克蛋白4种。

3. Western blot法检测各组细胞和大鼠组织中GMFβ蛋白表达：LX-2细胞IFNβ-1a处理组与对照组相比，GMFβ的蛋白表达显著增加（t＝1.81，P<0.01）（图2，3）。IFNβ-1a能增加LX-2细胞中GMFβ的蛋白表达，并呈量效依赖关系。正常大鼠肝组织中GMFβ的蛋白表达显著高于肝硬化大鼠肝组织（t＝2.53，P<0.01）（图4，5）。GMFβ蛋白在大鼠的脑、脾、肝、肾组织中明显表达，而肺、心组织中无表达（t＝1.91，P<0.01）（图6，7）。

4. RT-PCR法检测大鼠各种组织中GMFβ的mRNA表达：正常大鼠肝组织中GMFβ的mRNA表达量显著高于肝硬化大鼠肝组织（t＝2.13，P<0.01）（图4，5）。GMFβ的mRNA在大鼠的脑、脾、肝、肾组织中明显表达，而肺、心组织中无表达（t＝1.94，P<0.01）（图6，7）。

讨    论

IFNβ与IFNα来源于同一祖先基因，由相同的细胞在相同的刺激物诱导下产生，结合相同的受体，并发挥着相似的生物学效应。激活后的HSC具有生成细胞外基质，分泌细胞因子及收缩等多种功能，在肝纤维化发生、发展过程中起了关键性作用[5]。肝硬化患者肝组织TGFβRI、TGFβRⅡ、Smad2、Smad4 mRNA和蛋白表达有升高，Smad7 mRNA和蛋白表达下降[6]。Sakaida等[7]发现α-平滑肌肌动蛋白在HSC的表达与肝纤维化有关，而IFNβ可以减少这种表达，从而减轻肝纤维化。我们前期研究也发现IFNβ能通过下调转化生长因子β1、Smad4、血小板衍生生长因子-BB的蛋白表达，上调Smad7的蛋白表达，抑制HSC的激活，发挥抗肝纤维化的作用[3]。这些研究显示IFNβ能抑制肝脏纤维化，能对HSC的生物学活性产生影响。

Kristensen等[8]应用蛋白质组技术对体内、体外活化的HSC与静止HSC的蛋白质表达进行比较，结果鉴定出43种差异表达的蛋白，其中体内体外结果一致的有27种蛋白质，包括上调的蛋白：钙周期蛋白、calgizzarin和半乳凝素-1等和下调的蛋白：肝羧酸酯酶10和丝氨酸蛋白酶抑制剂3等。他们另外鉴定出150种以上的蛋白质，为HSC蛋白质组的研究提供了线索。之后他们对其中新发现的1个未知蛋白进行研究，发现这个蛋白同α-SMA等分子一样，与HSC的激活密切相关，命名为星状细胞活化相关蛋白，这种蛋白为细胞珠蛋白，仅定位于内脏的成纤维样细胞，并且与脏器的纤维化有关[9]。本研究中，通过对IFNβ-1a处理后的LX-2细胞在二维电泳图谱中差异表达的31个蛋白点进行质谱和生物信息学分析，鉴定发现了20种差异表达蛋白，其中新出现1种蛋白GMFβ，表达上调2种蛋白，组蛋白H2A和β-原肌球蛋白，表达下调17种蛋白。经IFNβ-1a处理后的HSC中，蛋白表达水平绝大多数均是下调，包括反映HSC活化状态的蛋白，如波形蛋白，这也说明IFNβ-1a能抑制HSC的活化。在HSC中，IFNβ-1a能引起细胞骨架蛋白Cytovillin的下调，而细胞骨架蛋白降解是细胞凋亡的关键事件之一[10]，因此IFNβ-1a是否能诱导HSC的凋亡，有待进一步明确并探讨其机制。

IFNβ-1a处理后的HSC中，出现了GMFβ，而未经IFNβ-1a处理的活化的HSC中不存在该因子。进一步对GMFβ在LX-2中的表达进行验证，结果表明，IFNβ-1a处理后的LX-2中GMFβ的蛋白表达明显增多。 有研究报道，GMFβ在胎盘、肾脏和胰腺中也有微弱的表达。但是，GMFβ在肝组织中的表达情况目前未见文献报道。我们的研究发现，大鼠的脑、脾、肝、肾组织中均明显表达GMFβ，而肺、心组织中GMFβ几乎无表达。

GMFβ是神经元和神经胶质生长和分化的重要因子。Zaheer等[11]研究还发现GMFβ是细胞内信号转导的调节因子，能引起p38 MAP激酶和核转录因子NF-κB的活化，诱导GM-CSF mRNA和蛋白的合成。GMFβ也可以由胸腺上皮细胞或胸腺瘤生成，在CD4+ T淋巴细胞的发育中起重要的作用[12]。GMFβ能在蛋白负荷性蛋白尿大鼠的近端肾小管细胞表达，经p38信号途径激活，近端肾小管细胞过度表达GMFβ，持续性氧化应激加速细胞死亡[13]。但是，GMFβ在肝组织中对肝纤维化和肝脏的其他功能影响的相关研究未见报道。本研究结果显示，正常大鼠肝组织中GMFβ的mRNA和蛋白表达量显著高于肝硬化大鼠的肝组织，可见GMFβ能对HSC的活化和肝纤维化的进展产生影响。GMFβ抑制HSC的活化以及抑制肝纤维化进展，可能通过抑制HSC的活化通路或加速活化HSC的凋亡来实现，但具体的机制应进一步研究明确。

IFN-β-1a处理前后LX-2的蛋白质组具有差异，这些差异表达的蛋白质可能参与了IFN-β-1a对HSC活化的抑制以及HSC的凋亡。IFN-β-1a处理后的LX-2以及正常大鼠的肝组织中GMFβ有明显的表达，GMFβ的表达升高能抑制HSC的活化以及抑制肝纤维化的进展，但是应进一步进行GMFβ在HSC和肝组织中的功能研究。

参  考  文  献

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