【摘要】 目的 观察转化生长因子β3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）Ⅰ型胶原合成的影响。 方法 TGFβ3表达质粒［pcDNA3.1(+)-TGFβ3］和TGFβ1表达质粒［pcDNA3.1(+)-TGFβ1］的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3.1(+)-TGFβ1、pcDNA3.1(+)-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC-T6细胞，荧光定量PCR法及Western blot法分别检测转染后TGFβ1、TGFβ3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染HSC-T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFβ1的HSC-T6细胞克隆，pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Western blot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。 结果 构建的pcDNA3.1(+)-TGFβ3、pcDNA3.1(+)-TGFβ1质粒可转染HSC-T6细胞，转染率28.2%。pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P<0.05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染组明显降低（P<0.05）。TGFβ3转染克隆细胞后，TGFβ1 mRNA表达较克隆组无明显改变（P>0.05），而蛋白质表达明显下降（P<0.05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P<0.05）。 结论 TGFβ3基因转染正常培养的HSC-T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC-T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。 【关键词】 转化生长因子β3； 肝星状细胞； Ⅰ型胶原 Effects of transforming growth factor-beta 3 gene transfer on type I collagen synthesis of hepatic stellate cells ZHOU Xia, YU Jiao, LI Qi, QIAN Wei, XU Ke-shu. Department of Gastroenterology, Affiliated Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China Corresponding author: XU Ke-shu, Email: xuzou@ medmail.com.cn 【Abstract】 Objective To observe the effects of transforming growth factor-beta 3 gene transfer on type I collagen synthesis of cells of HSC-T6. Methods Transforming growth factor-beta 1 expression plasmid and transforming growth factor-beta 3 expression plasmid were constructed. The recombinant expression plasmids pcDNA3.1(+)-TGFβ1 and pcDNA3.1(+)-TGFβ3 were respectively transfected and cotransfected into cultured HSC-T6 cells; expression of TGFβ1, TGFβ3, type I collagen mRNA were detected by real-time quantitative PCR, expression of TGFβ1 and type I collagen protein were detected by Western blot. The recombinant expression plasmid pcDNA3.1(+)-TGFβ1 was transfected into cultured HSC-T6 cells; positive clones were selected by G418. The positive clones were transfected by the recombinant expression plasmid pcDNA3.1(+)-TGFβ3; expression of TGFβ1, TGFβ3 and type I collagen mRNA were detected by real-time quantitative PCR; expression of TGFβ1 and type I collagen protein were detected by Western blot. Results HSC-T6 was transfected by recombinant expression plasmid pcDNA3.1(+)-TGFβ1 and pcDNA3.1(+)-TGFβ3 and the transfection efficiency was 28.2%. After the cells were transfected with pcDNA3.1-TGFβ3, type I collagen mRNA and the protein expression in the cells were higher than those in the untransfected cells (control group) (P < 0.05). The increase reached to the maximal at 72 h after the transfection. Expressions of type I collagen mRNA and the protein in the cells transfected by pcDNA3.1(+)-TGFβ1 were higher than in those cotransfected by pcDNA3.1(+)-TGFβ1 and pcDNA3.1(+)-TGFβ3 (P < 0.05). TGFβ1 protein, type I collagen mRNA and type I collagen protein expression significantly decreased in the clones transfected by recombinant expression plasmid pcDNA3.1(+)-TGFβ3 (P < 0.05), but the changes of TGFβ1 mRNA were not significant (P > 0.05). Conclusions Expression of type I collagen increased after the cultured HSC-T6 cells were transfected by TGFβ3 gene. The significant decrease of the expression of type I collagen of the TGFβ3 gene transfected positive clones suggests that TGFβ3 could inhibit the ocurrence of liver fibrosis. 【Key words】 Transforming growth factor beta 3; Hepatic stellate cell; Type I collagen 转化生长因子β(TGFβ)家族是抑制细胞生长和促进纤维生成的生长因子超家族，在调控细胞增殖和分化、细胞外基质（ECM）成分的代谢、损伤愈合和器官纤维化的病理过程中发挥重要作用。TGFβ有5个亚型，在哺乳动物细胞和组织中表达的有TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。TGFβ1是已知最强的促肝纤维化因子，通过促进肝星状细胞（HSC）活化和ECM的产生，从而启动肝纤维化过程[1]。TGFβ3可抑制皮肤瘢痕胶原的沉积[2]，但其与肝纤维化的关系尚不清楚。本研究采用转基因技术，建立稳定表达TGFβ1基因的大鼠HSC克隆，观察TGFβ3基因对克隆细胞I型胶原表达的影响，进一步探讨TGFβ3在肝纤维化中的作用。 材料与方法 一、材料 大鼠肝星状细胞株HSC-T6由武汉协和医院胃肠病实验室提供。 pcDNA3.1(+)质粒、感受态大肠杆菌DH-5α购自武汉晶赛生物工程技术公司，限制性核酸内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、SmaⅠ、BglⅡ、XbaⅠ、BamHⅠ、NheⅠ、T4多聚核苷酸激酶和Taq酶购自日本TaKaRa公司，T4 DNA连接酶购自New England Biolabs，凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司，寡核苷酸DNA单链由上海博亚生物技术有限公司合成。阳离子脂质体Lipofectaming 2000、TRIzolTM Reagent购自美国Invitrogen公司，新生SD大鼠由同济医学院实验中心提供。 二、方法 1. HSC-T6细胞株的培养：HSC-T6细胞用含15%胎牛血清（FCS）的DMEM液，置于37℃，体积分数为5% CO2孵育箱中培养。 2. 质粒构建：（1）引物设计与PCR扩增：根据已知的大鼠TGFβ1和TGFβ3基因序列合成目的片段引物：TGFβ1引物：上游为5′-GGAATTCGCCA CCATGGGCATGCCGCCCTCGGGGCT-3′，下游为5′-CCGCTCGAGTCAGCTGCACTTGCAGG AGCG-3′；TGFβ3引物：上游为5′-CGGGATC CGCCACCATGGGCATGAAGATGCACTTACAAA GGGCTC-3′，下游为5′-CCTCAGCTGCACTT ACACGACTT-3′。提取新生大鼠成骨细胞RNA，扩增获得cDNA。TGFβ1引物的两端有EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点。以大鼠cDNA为模板扩增TGFβ1基因中1.2kb的目的片段，PCR程序为：94℃变性5min；94℃ 20s，60℃ 25s，72℃ 75s，33个循环；72℃ 3min，同时以大鼠cDNA为模板扩增TGFβ3基因中约1.2kb大小的目的片段。PCR程序为：94℃变性5min；94℃ 20s，58℃ 25s，72℃ 80s，33个循环；72℃ 3min。凝胶电泳回收TGFβ1和TGFβ3 PCR产物，分别将TGFβ1和TGFβ3产物连接T载体，限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切TGFβ1产物回收1.2kb的酶切产物，限制性内切酶SmaⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ酶切TGFβ3产物回收1.2kb的酶切产物。（2）表达载体构建：TGFβ1酶切产物通过T4连接酶与EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的质粒pcDNA3.1(+)连接，TGFβ3酶切产物通过T4连接酶与XbaⅠ和BamHⅠ酶切的质粒pcDNA3.1(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH-5α，新霉素抗性筛选重组子pcDNA3.1(+)-TGFβ1及pcDNA3.1(+)-TGFβ3。酶切鉴定成功后，菌液送上海英俊公司进行测序分析。同时，用含绿色荧光蛋白的pcDNA3.1(+)-EGFP为阴性对照质粒。 3. HSC-T6细胞株的瞬时转染：将HSC-T6细胞在含有15% FCS的DMEM培养液连续培养。转染前1d，将HSC-T6细胞接种于6孔培养板，每孔2×105个细胞，过夜培养后将构建的质粒pcDNA3.1(+)-TGFβ1、pcDNA3.1(+)-TGFβ3分别及共转染细胞，操作按脂质体Lipofectamine 2000转染手册进行。取一试管加入质粒2μg，共转染组4μg，用250μl Opti-MEM培养基混合稀释，另一试管加入脂质体Lipofectamine 2000 5μl，共转染组10μl，用250μl Opti-MEM培养基混合稀释。室温无菌条件下放置5min，两试管液体混合后放置20min，在6孔板中每孔加入量为500μl混合液培养3h，更换培养液继续培养。细胞分5组：正常对照组、pcDNA3.1(+)-EGFP质粒转染的阴性对照组、pcDNA3.1(+)-TGFβ1质粒转染组、pcDNA3.1(+)-TGFβ3质粒转染组、pcDNA3.1(+)-TGFβ1和pcDNA3.1(+)-TGFβ3共转染组。取转染后24、48、72h细胞进行检测分析，每组设3个复孔，每个实验均重复3次，根据绿色荧光蛋白（GFP）表达后发绿色荧光的特点，在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，从而确定转染效率。 4. 高表达TGFβ1的HSC-T6细胞株阳性克隆的筛选：pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染HSC-T6细胞，48h后改用含400μg/ml G418、15% FCS的DMEM培养液2ml，6d后细胞大部分死亡，G418浓度减至200μg/ml维持筛选。残存细胞约14d后形成阳性克隆，更换为正常培养液继续培养和传代。 5. TGFβ3转染阳性细胞克隆：将扩增后的克隆细胞接种至6孔培养板，运用pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染克隆细胞，细胞分4组：空白组、对照组、TGFβ1克隆组、TGFβ3干预组，取转染后48h细胞进行检测分析，每组设3个复孔，每个实验均重复3次。 6. 荧光定量PCR法检测TGFβ1、TGFβ3和Ⅰ型胶原mRNA的表达：收集上述各组细胞，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，荧光定量PCR法扩增各组细胞TGFβ1、TGFβ3和Ⅰ型胶原mRNA。按定量RT-PCR试剂盒说明取1μg总RNA逆转录合成cDNA，然后以Sybr GreenⅠ作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪（购自德国Roche公司）上进行PCR反应。PCR引物：TGFβ1上游引物为5′-GAGGCGGTGCTCGCTTTGTA-3′，下游引物为5′-TTGTTGCGGTCCACCATTAGC-3′；TGFβ3上游引物为5′-CGCTACATAGGTG GCAAGAAT-3′，下游引物为5′-GTATGTCTCC ATTGGGCTGAAA-3′；Ⅰ型胶原上游引物为5′-GGGGCAAGACAGTCATCGAA-3′，下游引物为5′-GGATGGAGGGAGTTTACACGAA-3′；β-肌动蛋白上游引物为5′-AGCAGAGAATGGAAA GTCAAA-3′，下游引物为5′-ATGCTGCTTACA TGTCTCGAT-3′。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，△△Ct法进行相对定量。 7. Western blot法测定TGFβ1和I型胶原蛋白的表达：收集各组细胞，消化后加入预冷的细胞裂解液，置冰上30min，4℃、12000×g离心，取上清液进行蛋白分光光度仪定量（考马斯亮蓝法），每组取20μg蛋白加热变性后，10% SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液封闭2h，分别加入1∶200稀释的兔抗TGFβ1多克隆抗体，1∶150稀释的小鼠抗I型胶原单克隆抗体，4℃孵育过夜。用含吐温-20的TBS缓冲液洗膜3次，相应加入1∶5000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔第二抗体及1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠第二抗体，室温下孵育1h。化学发光法（ECL）检测条带。β-肌动蛋白作为内参照。上述实验均重复3次。计算机扫描电泳图像，测出各条带面积灰度值。 8. 统计学分析：采用SPSS11.5统计软件，实验数据均以x-±s表示，数据显著性检验用方差分析，并进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。 结 果 1. 重组质粒的鉴定：重组质粒pcDNA3.1(+)-TGFβ1用BamHⅠ酶切，经12g/L琼脂糖凝胶电泳后可见约1.2kb的清晰条带，pcDNA3.1(+)-TGFβ3质粒用NheⅠ、XbaⅠ酶切后电泳可见约1253bp的清晰条带。分别进行测序，结果与GenBank所提供的序列相同，提示分别含有TGFβ1、TGFβ3基因的pcDNA3.1(+)构建成功（图1，2略）。 2. 脂质体Lipofectamine 2000对细胞的毒性作用和G418筛选结果：应用转染试剂Lipofectamine 2000转染HSC-T6细胞后镜下观察显示，在5μl的用量下HSC-T6细胞转染前、后的形态和数目与对照组及空白组无明显差异，瞬时转染48h后测得转染率为28.2%（图3）。筛选结果显示，G418筛选试剂的最佳浓度为400μg/ml，应用约21d后可筛选出稳定表达的细胞克隆，并能进一步培养和传代。 3. TGFβ1 mRNA表达情况：荧光定量PCR法检测TGFβ1 mRNA表达，结果显示：pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染细胞后，TGFβ1 mRNA表达较空白组及对照组明显增高，以48h增高最为明显（分别为17.381±3.552、7.603±1.121、6.994±3.145，P值均<0.05）。经G418筛选后，TGFβ1 mRNA仍有较高表达（分别为16.472±2.636、7.603±1.121、6.994±3.145，P值均<0.05）。pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染阳性克隆细胞后，TGFβ1 mRNA与克隆组相比无明显改变（14.279±1.643对比16.472±2.636，P>0.05）。 4. TGFβ3 mRNA表达情况：荧光定量PCR法检测TGFβ3 mRNA表达。pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染正常培养HSC-T6细胞后，TGFβ3 mRNA表达较空白组及对照组增加，以48h增加最为明显（分别为11.479±0.853、5.010±0.684、2.690±1.004，P值均<0.05）；pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染克隆细胞后，TGFβ3 mRNA表达较克隆组、空白组及对照组明显增高（分别为11.233±0.258、5.794±3.573、5.010±0.684、2.690±1.004，P值均<0.05）。 5. Ⅰ型胶原mRNA的表达情况：荧光定量PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA表达。pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染正常培养HSC-T6细胞后，Ⅰ型胶原mRNA表达较空白组及对照组增加，以48h增高最为明显（分别为11.867±2.053 、5.482±3.383、6.546±1.021，P值均<0.05，见图4略）；pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染HSC-T6细胞后，Ⅰ型胶原mRNA表达也较空白组及对照组增加，以72h增加最为明显（分别为11.461±0.166、5.482±3.383、6.546±1.021，P值均<0.05，见图5）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA表达与空白组及对照组无明显差异（分别为6.141±1.868、 8.566±0.979、 6.925±1.189，P值均>0.05），较pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染组明显下降（6.141±1.868对比12.678±0.894，P<0.05，见图6）；经G418筛选，TGFβ1克隆组I型胶原mRNA亦明显增高（分别为13.708±0.424、5.482±3.383、6.546±1.021，P值均< 0.05）；pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染克隆细胞后，Ⅰ型胶原mRNA表达较克隆组明显降低（7.17±0.979对比13.708±0.424，P<0.05，见图7略）。 6. TGFβ1蛋白表达情况：Western blot法检测TGFβ1蛋白表达。TGFβ1在SDS-PAGE凝胶电泳中表现为相对分子质量为4.6×104的条带，pcDNA3.1 (+)-TGFβ1质粒转染细胞，24、48、72h后TGFβ1/β-肌动蛋白比值分别为0.966±0.017，1.064±0.025，0.949±0.066，较空白组（0.096±0.029）及对照组（0.072±0.026）明显增高（P<0.05，图8）；经G418筛选阳性克隆形成后，TGFβ1/β-肌动蛋白比值为1.057±0.095，较空白组（0.105±0.032）及对照组（0.136±0.043）明显增高（P<0.05），pcDNA3.1(+)-TGFβ3质粒转染克隆细胞后TGFβ1/β-肌动蛋白比值为0.908±0.081，较克隆组明显下降（P<0.05，图8）。 7. Ⅰ型胶原蛋白的表达情况：Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白表达。TGFβ1在SDS-PAGE凝胶电泳中表现为相对分子质量为9.5×104的条带，pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染细胞，24、48、72h后 Ⅰ型胶原蛋白表达较空白组及对照组增高，48h增高最明显（I型胶原/β-肌动蛋白比值分别为0.419±0.063、 0.219±0.061、0.221±0.073，P值均<0.05，图4）；pcDNA3.1(+)-TGFβ3转染细胞后24、48、72h Ⅰ型胶原蛋白表达较空白组及对照组增高，72h增高最明显（Ⅰ型胶原/β-肌动蛋白比值分别为0.417±0.130、0.169±0.071、0.152±0.064，P值均<0.05，见图5）；共转染组Ⅰ型胶原/β-肌动蛋白比值为0.249±0.057，较pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染组（0.489±0.110）明显降低（P< 0.05，图6）；阳性克隆形成后，Ⅰ型胶原/β-肌动蛋白比值为0.674±0.076，较空白组（0.490±0.042）及对照组（0.570±0.063）明显增高（P<0.05），pcDNA3.1(+)-TGFβ3质粒转染克隆细胞后，Ⅰ型胶原/β-肌动蛋白比值为0.194±0.013，较克隆组明显下降（P<0.05，图7略）。 讨 论 HSC是肝纤维化的细胞学基础，HSC活化合成大量ECM是肝纤维化形成的直接原因[3]。TGFβ1是HSC活化、促进纤维化的关键细胞因子，研究提示TGFβ1在肝纤维化过程中呈较高表达，可促进静止及活化HSC表达Ⅰ型胶原[4，5]。本研究结果亦显示，将TGFβ1基因瞬时转染HSC后，HSC合成TGFβ1和Ⅰ型胶原的量明显增高，其中以48h达高峰绿色荧光蛋白计数法测得转染率为28.2%，高于国外报道的转染率10%[6]。 TGFβ3是TGFβs超家族成员之一，最近，TGFβ3对创面愈合影响的研究颇受关注,在促进创面愈合和减少瘢痕形成中具有重要作用[7]。在创面修复过程中，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成均涉及愈合过程中创面局部TGFβ1的过多产生，TGFβ3通过与TGFβs膜受体的竞争性结合，部分阻断或下调TGFβ1的激活或表达[8]，从而抑制了TGFβ1对瘢痕形成的诱导作用。将外源性重组TGFβ3基因导入外伤的动物体内后可抑制成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达，Ⅰ型胶原沉积减少，可显著改善伤后瘢痕，显示出良好的抗瘢痕作用[2，9]。另有研究结果显示TGFβ3能减少胰腺星状细胞的胶原分泌，具有抗胰腺纤维化功能[10]。鉴于HSC与胰腺星状细胞起源于同一中胚层，本研究运用TGFβ1转染HSC，建立高表达TGFβ1的细胞克隆，模拟肝纤维化时的体内环境，用TGFβ3转染克隆细胞，目的在于探讨和验证TGFβ3对HSC胶原合成的影响。实验结果显示：TGFβ3或TGFβ1在单独转染HSC-T6细胞株后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达均呈增高趋势，但TGFβ3与TGFβ1共转染HSC-T6细胞株后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白表达较单纯转染TGFβ1组或TGFβ3组明显降低。TGFβ3转染克隆细胞后，TGFβ1蛋白的表达较克隆细胞明显降低，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达亦明显降低。提示TGFβ3对HSC胶原合成的影响可能与TGFβ1的表达相关。应用放射线照射肝脏，并检测在造成纤维化病理改变前TGFβ1和TGFβ3的表达，发现在肝纤维化早期TGFβ1和TGFβ3两者的表达有不同特征，并存在相互作用：TGFβ1呈正调节作用，促进纤维化的发展，而TGFβ3可能起负调节作用[11]。 静止状态下的HSC仅表达少量TGFβ1，若导入TGFβ3可能会促进胶原的合成；随着肝纤维化的发生和发展，HSC呈活化状态并高表达TGFβ1，此时TGFβ3则通过下调TGFβ1蛋白的表达从而抑制HSC合成I型胶原，阻止肝纤维化的出现。唐世杰等[12]的研究结果亦显示，外源性TGFβ3通过下调增生性瘢痕组织中成纤维细胞的TGFβ1蛋白表达，从而减少胶原合成。在动脉吻合部位注入TGFβ3可减少弹力蛋白及Ⅲ型胶原的合成[11]。TGFβ3可能通过抑制TGFβ1下游因子纤溶酶原激活物抑制剂-1的合成而拮抗TGFβ1的作用[13]。推测TGFβ3在肝纤维化形成过程中可能通过抑制TGFβ1等致纤维化因子的合成而减少TGFβ1活性，抑制纤维化的发展。在本研究过程中还发现TGFβ3在转染克隆细胞后，TGFβ1的mRNA虽无明显变化，然而蛋白质的表达量明显降低，提示TGFβ3对TGFβ1的抑制作用主要在蛋白质水平，但其具体的抑制部位和机制需进一步的研究。 参 考 文 献 [1]Gressner AM, Weiskirchen R. 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