【摘要】目的 建立和复制一种适合大鼠药物血清进行脂肪肝脂毒性药理研究的体外模型。 方法 以大鼠血清替代胎牛血清培养HepG2细胞,添加长链游离脂肪酸(油酸1mmol/L、棕榈酸0.5mmol/L)刺激,观察上清液中肿瘤坏死因子(TNF)α含量、细胞内甘油三酯含量,细胞脂肪油红染色及电镜下观察超微结构变化;同时观察细胞TNFα蛋白及其基因表达,细胞组织蛋白酶B(ctsb)表达和分布的变化。 结果 游离脂肪酸刺激24h后,HepG2细胞内甘油三酯显著沉积, 高达627.24mg/g(t=23.6,P<0.01);上清液中TNFα含量显著升高,增至52.04pg/mg(t=2.6, P<0.05);细胞ctsb、TNFα的蛋白表达及其mRNA表达均显著增强。 结论 在大鼠血清培养环境下,游离脂肪酸可通过对ctsb作用显著诱导HepG2细胞脂肪变性和TNFα分泌,方法简易经济,可作为一种较理想的抗脂肪肝脂毒性药理研究模型。 【关键词】游离脂肪酸类; 甘油三酯类; 肿瘤坏死因子α; 模型,动物 An in vitro model applicable for fatty liver lipotoxicity pharmacological research HU Yi-yang, ZHANG Hui, CHEN Shao-dong, FENG Qin, LU Xiong, TANG Ying-zi. Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Institute of Liver Diseases of Shanghai University of T.C.M., Shanghai 201203, China Email: yyhuliver@ 163.com 【Abstract】Objective To establish an in vitro model applicable for fatty liver lipotoxicity pharmacological research. Methods HepG2 cells were cultured with rat serum instead of fetal bovine serum and with long-chain free fatty acid (FFA) added. The tested indices were: the content of serum TNFα, cellular triglycerides (TG) content, Oil Red staining and ultrastructural changes; protein expression and gene expression of cellular TNFα, and the expression and distribution of cathepsin B (Ctsb). Results After incubation with FFA for 24 hours, the TG deposition of HepG2 in the model group increased markedly and TG content was 627.24 mg/g protein (t = 23.6, P < 0.01), TNFα content in the cell supernatant also increased to 52.04 pg/mg protein (t = 2.6, P < 0.05). Compared with those of the normal group, the protein expression and mRNA expression of cellular TNFα and Ctsb also increased significantly. Conclusion FFA could induce a model of HepG2 steatosis with TNFα secretion through the Ctsb signal pathway using rat serum in the culture media. The method is simple and economical, which is an ideal model applicable for fatty liver lipotoxicity pharmacological research. 【Key words】Free fatty acids; Triglycerides; Tumor necrosis factor-alpha; Model, animal 游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)是引起胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)、代谢综合征的最主要非激素之一。高FFA血症可引起肝脏脂毒性增加,造成肝损伤,是非酒精性脂肪性肝病发病机制的重要因素。Feldstein等[1]发现FFA可以通过肝细胞溶酶体途径刺激肿瘤坏死因子(TNF)α表达,造成肝脏脂毒性。本研究旨在根据Feldstein方法,复制和建立FFA诱导肝细胞脂肪变性和TNFα分泌的体外模型,并改良以大鼠血清培养的方法,以利适合实验研究中较多采用的大鼠药物血清研究技术和方法,为筛选有效的脂肪肝防治药物尤其是我国中药研究提供技术平台。 材料与方法 1. 细胞株:采用人肝癌细胞株HepG2,购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。 2. 主要试剂及设备:胎牛血清(FBS)购自中国上海实生细胞生物技术有限公司。MEM培养基干粉购自美国Gibco公司;棕榈酸(P0500)、油酸(O1008)均购自美国Sigma公司。甘油三酯、乳酸脱氢酶(LDH)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自中国南京建成生物制品研究所,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中国碧云天公司;大鼠TNFα检测试剂盒购自美国R&D公司;油红O购自中国上海化学试剂站。多克隆羊抗大鼠TNFα抗体购自美国R&D公司。磷酸化IκB抗体#9246购自美国cell signaling technology公司。组织蛋白酶B(cathepsin B,ctsb)多克隆抗体购自美国cell signaling technology公司。单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体购自中国康成生物科技公司。多克隆兔抗羊Ⅱ抗购自美国Jackson Immunoresearch Laboratories Inc公司。抗兔IgG多克隆第二抗体、单克隆第二抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。抗兔IgG(H+L)CYTM5,Cat. No.62-6120, LOT: 30979557购自美国Zymed公司。总RNA抽提试剂盒Trizol购自美国Invitrogen公司。琼脂糖购自中国华美公司,DNA相对分子质量标准品购自德国Tiangen公司。cDNA合成试剂盒、PCR试剂盒均购自美国Fermentas公司。TNFα引物为5′-CATGATC CGAGATGTGGAACTGGC-3′和5′-CTGGCTCA GCCACTCCAGC-3′,ctsb引物为5′-TGAGGTA GACAGGGGAGTCTTT-3′, 5′-GTGTTTGGA GGGTAGCTCTGAT-3′,由中国生工生物工程公司合成。0.22μm、0.45μm微孔虑膜购自中国上海半岛实业有限公司净化器材厂。60mm培养皿、6、24、96孔培养板均购自美国Corning公司。低温高速离心机(1.0R)和CO2培养箱购自德国Heraeus公司。HFsafe-1500型生物安全柜购自中国香港Heal Force公司,分析电子天平购自美国Denver公司,高压消毒锅购自美国Yamato Scientificwc公司产品。PCR扩增仪Rotor-Gene RG-3000购自澳大利亚Corbett Research公司。JY200电泳仪,购自中国北京市君意机电技术公司。激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP2)购自德国Leica公司。 3. 细胞培养方法:HepG2细胞株以0.25%胰酶/0.02% EDTA消化传代,以含10% FBS的MEM培养液在含5% CO2、95%空气的37℃培养箱中培养。 4. FFA添加方法和作用时间点的选择:正常组细胞培养液为含10% FBS的低限量基础培养基;模型组在上述培养液中加入长链游离脂肪酸(油酸∶棕榈酸浓度为1∶0.5mmol/L,剂量参考文献[1]),分别在6、12、18、24、30h收集细胞, 参考Heider等[2]的方法提取细胞层总脂质,检测甘油三酯含量。确定造模时间点。各组每时间点设3皿(n=3)。 5. 大鼠血清制备:SD雄性大鼠,SPF级,300g左右,上海中医药大学实验动物中心提供。普通饲料喂养,自由饮水。在无菌条件下从腹腔静脉取血,静置3~4h,3000r/min、4℃离心20min,超净台上分离血清。将分离得到的血清置于56℃水浴中30min灭活,-70℃冷藏备用。 6. 大鼠血清替代FBS进行细胞培养的条件确认:为了适合实验研究中常采取的大鼠血清药理实验,对正常大鼠血清与FBS的细胞的自身毒性作用比较,在明确大鼠血清对细胞毒性与FBS无差异前提下,后续研究采用大鼠血清培养进行研究。 7. 检测指标:HepG2细胞培养24~48h,细胞长满70%~80%时,换液,分正常组、模型组,每组各4皿,正常组、模型组添加10%正常大鼠血清,孵育6h后,模型组添加长链游离脂肪酸(油酸∶棕榈酸为1∶0.5)。刺激24h(根据所确定的造模时间点)后收集标本。观察:(1)上清液TNFα含量,采用ELISA法;(2)细胞内甘油三酯含量,参考Heider等[2]的方法提取细胞层总脂质进行测定;(3)细胞油红染色观察脂肪变程度;(4)透射电镜观察细胞超微结构变化;(5)细胞ctsb、TNFα蛋白表达(Western blot法)及其mRNA表达(RT-PCR法);(6)细胞ctsb的表达和分布,细胞免疫荧光法,激光扫描共聚焦显微镜观察。 8. 统计学处理:数据用SPSS11.0软件包进行统计学分析,组间比较用t检验。 结 果 1. 模型制备作用时间点的选择:10% FBS的低限量基础培养基培养HepG2细胞,添加FFA刺激6h后,细胞内甘油三酯含量就明显增加,随时间的延长,甘油三酯含量逐渐上升,在18h时增至363mg/g,在24h时达539mg/g, 和对照组比差异有统计学意义。FFA刺激30h时,甘油三酯含量有所下降。故后续实验以FFA刺激24h为造模时间截止点。本实验曾重复3次,结果显示趋势相同,见表1。 2. 正常大鼠血清与胎牛血清对细胞的毒性作用比较:在相同浓度下,正常大鼠血清与FBS培养的HepG2细胞,其上清液中LDH活性,差异无统计学意义(本实验重复2次结果一致)。但两者均随浓度增加其LDH活性上升,提示一定浓度的血清自身存在毒性作用。而正常大鼠血清与FBS对细胞的影响无差异,提示可根据实验需要以大鼠血清替代FBS进行该细胞的培养和模型研究。为了减少血清本身的影响,后续实验正常对照组及模型对照组均加10%正常大鼠血清,见表2。 表1 (略) 表2 (略) 3. 大鼠血清培养条件下FFA对HepG2细胞内甘油三酯沉积的影响:(1)细胞内甘油三酯含量及细胞上清液TNFα含量的影响:FFA刺激24h后,FFA+ 10%正常大鼠血清组HepG2细胞内甘油三酯含量升高至3倍以上,高达(627.2±27.7)mg/g, 10%正常大鼠血清组甘油三酯含量为(163.4±27.9)mg/g,t=23.6, P<0.01,差异有统计学意义。FFA+10%正常大鼠血清组细胞上清液TNFα含量为(52.0±13.0)pg/mg,10%正常大鼠血清组细胞上清液TNFα含量为(34.9±2.3)pg/mg,t=2.6, P< 0.05,差异有统计学意义。(2)细胞油红染色变化:10%正常大鼠血清组HepG2细胞呈不规则多角形或卵圆形生长,胞质染色浅淡或无明显着色。FFA刺激后,胞质内广泛着色,红色脂滴大而多,见图1。(3)电镜下观察细胞脂滴变化:10%正常大鼠血清组HepG2细胞大小不一,核异型性明显,核浆比例增大,核仁清晰,胞质内偶见小脂滴。FFA刺激后细胞胞质内可见大量的大小不一的卵圆形或圆形脂滴沉积,线粒体、内质网等细胞器明显减少,细胞核因大量脂滴挤压而变形,见图2。 4. FFA对HepG2细胞TNFα蛋白表达及mRNA表达的影响:经FFA刺激后,HepG2细胞TNFα蛋白表达及mRNA表达均显著增加,见图3,4。 5. FFA对HepG2细胞ctsb蛋白表达及mRNA表达的影响:经FFA刺激后,HepG2细胞ctsb蛋白表达及mRNA表达均显著增强(图3,4)。细胞免疫荧光法观察到胞质中ctsb呈强阳性表达,见图5。 讨 论 生理条件下,FFA是细胞膜脂质结构和前列腺素合成的供体,也是人体重要的能源物质之一。但是,病理状态下,FFA具有很强的细胞毒性,它可作为去垢剂损害细胞质、线粒体和溶酶体膜等,引起生物膜损伤[3]。FFA作为潜在的细胞毒素,能引起脂质在非脂肪组织中过量蓄积,进而引起细胞损伤和死亡,因此是一个重要的脂毒性介导因子[4]。 FFA异常增多可抑制胰岛素受体底物/磷脂酰肌醇-3激酶信号途径,通过多种方式引起胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱,在非酒精性脂肪性肝病的发病中起着重要的作用[5]。 Feldstein等[1]通过HepG2细胞和体外分离的肝细胞研究部分阐明了非酒精性脂肪肝发病过程中FFA与TNFα这两个重要因子之间的关系,并为非酒精性脂肪肝的研究提供了一种相对稳定的体外模型。此外,HepG2细胞虽为肿瘤细胞,但Feldstein等[1]的这项研究结果提示可以获得和肝细胞一样的模型效果,使这一模型运用更为便捷。 TNFα是机体产生的重要内源性促炎症介质,是导致多种损伤的最重要的具有始动效应的细胞因子之一。脂肪肝发生时,P4502E1的过量表达导致肝细胞对TNFα刺激的敏感性增加,成为导致脂肪性肝炎发生的重要因子[6]。ctsb是溶酶体内一种半胱氨酸蛋白酶。Werneburg等[7]发现,ctsb在TNFα诱导的肝脏损伤中发挥着重要的作用,TNFα通过caspase 8和Bid介导可引起溶酶体释放ctsb。 Guicciardi等[8]敲除小鼠ctsb基因后,发现能够对抗TNFα相关的肝细胞凋亡,其作用机制在于抑制线粒体释放细胞色素C和caspase的活化。 本研究根据Feldstein报道的方法和剂量,将长链游离脂肪酸直接添加至细胞培液中,孵育24h,模型组甘油三酯含量达到峰值,增至3倍以上。我们改以大鼠血清后,其甘油三酯含量的变化幅度与FBS培养的结果一致。说明该实验不受大鼠血清影响。进一步观察可见,上清液中TNFα含量明显增加,RT-PCR和Western blot分析表明,FFA刺激后,细胞ctsb、TNFα mRNA表达及其蛋白表达显著增强,与Feldstein等[1]报道的结果相符。此外,我们还进一步通过油红染色及电镜超微结构观察到细胞内脂滴明显增多,通过细胞免疫荧光法观察到胞质中ctsb的表达和分布。 因此,在大鼠血清培养环境下,FFA可通过对ctsb作用显著诱导HepG2细胞脂肪变性和TNFα分泌。我们认为,该方法简易经济,可作为一种较理想的抗脂肪肝脂毒性药理研究模型。鉴于我国近年来脂肪肝防治研究中,中药的研究已越来越受到重视,在体外研究过程中,中药制剂常常不能直接添加作用于细胞而是采用“药物血清”。本研究为中药的相关研究和筛选提供了一种可行的体外模型。 参 考 文 献 [1]Feldstein AE, Werneburg NW, Canbay A, et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF-alpha expression via a lysosomal pathway. Hepatology, 2004, 40: 185-194. [2]Heider JG, Boyett RL. The picomole determination of free and total cholesterol in cells in culture. J Lipid Res, 1978, 19: 514-517. [3]Zeng MD. Glucotoxicity, lipotoxicity and the nonalcohol fatty liver disease. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 81-82. (in Chinese) 曾民德.葡萄糖毒性、脂肪毒性与非酒精性脂肪性肝病.中华肝脏病杂志,2005,13:81-82. [4]Unger RH. The physiology of cellular liporegulation. Annu Rev Physiol, 2003, 65: 333-347. [5]Boden G, Cheung P, Stein TP, et a1. FFA cause hepatic insulin resistance by inhibiting insulin suppression of glycogeno1sis. Am J physiol Endoerinol Metab, 2002, 283: E12-9. [6]Liu H, Jones BE, Bradham C, et al. Increased cytochrome P-450 2E1 expression sensitizes hepatocytes to c-Jun-mediated cell death from TNF-alpha. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2002,282: G257-G266. [7]Werneburg N, Guicciardi ME, Yin XM, et al. TNF-alpha-mediated lysosomal permeabilization is FAN and caspase 8/Bid dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physol, 2004, 287: G436-443. [8]Guicciardi ME, Miyoshi H, Bronk SF, et al. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-alpha-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol, 2001, 159: 2045-2054. 中华肝脏病杂志版权 |