【摘要】目的 探讨核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)基因沉默后对高糖刺激下小鼠肝细胞固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）表达的影响。 方法 将构建的S6K1shRNA重组基因腺病毒（S6K1Ax）注射进db/db小鼠尾静脉，以注射含pU6启动子的腺病毒（pU6Ax）空载体的db/db小鼠作对照组，HE染色观察肝脏病理改变并检测肝脏甘油三酯含量变化。S6K1Ax转染小鼠肝细胞AML12细胞，转染pU6Ax的作为对照组，分别用高糖、高胰岛素、高糖高胰岛素刺激，逆转录聚合酶链式反应分析肝细胞在各种条件刺激后mSREBP1c等的表达,Western blot检测db/db小鼠肝脏及AML12细胞S6K1的蛋白表达。 结果 db/db糖尿病小鼠注射S6K1Ax后1周，肝脏S6K1蛋白表达被抑制，对照组与实验组肝脏甘油三酯含量分别为（0.65±0.02）mmol/L和（0.56±0.01）mmol/L，t＝4.312，P<0.01，差异有统计学意义。HE染色显示实验组肝细胞胞质含脂肪滴减少，空泡细胞数量减少，脂肪肝得到改善。AML12肝细胞mSREBP1c表达实验组为0.03±0.01，对照组为0.06±0.01，t＝5.624，P<0.01，差异有统计学意义。与基础状态相比，给以胰岛素刺激后实验组和对照组mSREBP1c表达均增加，实验组上升至0.06±0.02，t＝8.452，P<0.01，对照组上升至0.08±0.02，t＝3.591，P<0.05。高糖刺激对实验组和对照组mSREBP1c表达均无明显影响。与高胰岛素刺激组相比，高糖高胰岛素刺激后实验组和对照组mSREBP1c表达均无明显差异。 结论 S6K1通过影响脂代谢的关键调控基因mSREBP1c表达参与了脂肪的合成，推测S6K1在脂肪肝的形成中发挥了重要作用。 【关键词】脂肪肝; 糖尿病； 核糖体蛋白S6激酶1； 固醇调节元件结合蛋白1c Role of S6K1 in the induction of SREBP1c in mouse hepatic cell by high glucose stimulation LI Shu-ying, CHEN Rui, LI Jing, WANG Bao-li, YU De-min. Department of Dialysis, Tianjin Medical University Metabolic Diseases Hospital, Tianjin 300070, China Corresponding author: YU De-min, Email: diaxierenshi@163.com 【Abstract】 Objective To study the role of S6K1 in the induction of SREBP1c in mouse hepatic cell by high glucose stimulation. Methods S6K1 shRNA recombinant adenovirus (S6K1Ax) was injected into tail vein of db/db mice and then hepatic triglycerol content was analyzed. Liver specimen were stained with HE. After transfection with S6K1Ax or pU6Ax, mouse hepatic AML12 cells were treated with high glucose, insulin or glucose and insulin, the expression of mSREBP1c was detected by RT-PCR. S6K1 protein was detected by Western blot. Results Hepatic S6K1 protein in db/db mice was inhibited a week after S6K1Ax injection. Compared with the control group, hepatic triglycerol content of S6K1Ax group was decreased (0.65±0.02) mmol/L vs (0.56±0.01) mmol/L (t = 4.312, P < 0.01), hepatocyte fat droplet and vaculor generation were also decreased, fatty liver was improved. The mSREBP1c expression in S6K1Ax transfected cells was lower than that in the control cells (0.03±0.01 vs 0.06±0.01, t = 5.624, P < 0.01). Compared with the basal state, SREBP1c expression of both groups was increased on the insulin stimulation, S6K1Ax group was 0.06±0.02 (t = 8.452, P < 0.01) and control group was 0.08±0.02 (t = 3.591, P < 0.05). There is no difference between control and S6K1Ax group by glucose addition (P > 0.05). Conclusion S6K1 acts on fatty synthesis by regulating mSREBP1c expression. 【Key words】Fatty liver; Diabetes mellitus; Ribosomal protein S6 kinase 1; Sterol regulatory element binding protein 1c 核糖体蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1），为雷帕霉素哺乳动物靶目标复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1）的重要作用底物，参与体内蛋白质的合成，调节细胞的生长与代谢[1]。最新研究发现，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）依赖的脂质合成需要mTORC1的激活，雷帕霉素抑制mTORC1活性后肝脏脂肪酸合成的关键调控元件固醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c, SREBP1c）的合成受到抑制，但机制不清[2]。本研究根据RNA干扰原理，利用已制备的S6K1shRNA重组基因腺病毒（S6K1Ax）将db/db小鼠肝脏S6K1基因特异性沉默后，观察对脂肪肝的影响，并在细胞水平检测S6K1基因沉默后对SREBP1c合成的影响，探讨S6K1在糖尿病脂肪肝代谢中的作用机制。 材料与方法 1.主要试剂：AML12细胞购自美国ATCC公司，DMEM/F12细胞培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清（FBS）、ITS培养基添加剂购自美国Sigma公司。逆转录PCR试剂购自美国Applied Biosystem公司，S6K1、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)的第一抗体购自美国Cell Signaling公司，β-肌动蛋白抗体购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶第二抗体购自美国Santa Cruz公司，电发光试剂购自英国Amersham公司。甘油三酯试剂盒购自日本和光制药。db/db小鼠购自日本clea株式会社，在神户大学实验动物中心感染室（防扩散级别 P2级）饲养、实验处置。对照用含pU6启动子的腺病毒（pU6Ax）空载体及S6K1shRNA重组基因腺病毒（S6K1 Ax）由日本神户大学糖尿病代谢内分泌内科实验室提供，S6K1Ax效价为2.1×1010pfu/ml，pU6Ax效价为2.0×1010pfu/ml。 2. 实验动物及分组：使用9周龄db/db糖尿病小鼠，体质量44.5～48.2g，随机分为实验组和对照组，每组各6只。对照组注射pU6 Ax 122μl，实验组注射S6K1 Ax 120μl。两组小鼠用普通饲料喂养，病毒注射1周后处死小鼠取肝脏，提取蛋白测定S6K1表达，酶法测定肝脏中甘油三酯的含量。 3. 肝组织病理：统一在db/db小鼠肝右叶相同部位取材，4%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度4μm，HE染色，光镜下观察。 4. AML12细胞的培养与转染：小鼠肝细胞系AML12细胞，用含10% FBS的DMEM/F12细胞培养基加ITS培养基添加物培养，细胞接种于6cm培养皿，将5μl S6K1Ax转染实验组细胞24h后，以不含病毒的细胞培养液继续10h培养后去血清培养16h，分别设立正常血糖组、高糖组、高胰岛素组及高糖加高胰岛素组，正常血糖组葡萄糖浓度为5.5mmol/L、高糖浓度为28mmol/L、高胰岛素浓度为100nmol/L，高糖加高胰岛素组为高糖28mmol/L+高胰岛素100nmol/L，条件刺激6h后回收提取肝细胞总RNA及蛋白质，对照组以pU6 Ax 5μl转染细胞。 5. Western blot检测：取db/db小鼠肝组织100mg左右，超声法将肝组织匀浆，提取肝脏蛋白。裂解缓冲液消化AML12细胞，提取总蛋白，2，2′-二辛可宁酸法测定蛋白浓度。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上样，肝组织蛋白样品为60μg，细胞蛋白样品为30μg，电泳分离蛋白质，转膜，封闭，S6K1第一抗体、GSK3β第一抗体（均1∶1000稀释）4℃孵育过夜，羊抗兔第二抗体（1∶5000稀释），室温孵育2h，化学发光法显色，LAS-mini3000检测蛋白表达。 6. 逆转录PCR检测mRNA表达：提取培养的肝细胞总RNA，微量核酸仪测定A260/280比值和浓度，取2μg总RNA，利用逆转录法合成cDNA，以36B4作为内参照。使用SYBR Green荧光染料标记。引物序列设计为：SREBP1c上游为5′-GAGC CATGGATTGCACATTT-3′，下游为5′-CACG GACGGGTACATCT-3′；FAS上游为5′- GCTGG CATTCGTGATGGAGTCGT-3′，下游为5′-AGGCCACCAGTGATGATGTAACTCT-3′；GK上游为5′-CCCTGAGTGGCTTACAGTTC-3′，下游为5′-ACGGATGTGAGTGTTGAAGC-3’；内参照36B4上游为5′-GAGGAATCAGATGAGGA TATGGGA-3′，下游为5′- AAGCAGGCTGACT TGGTTGC-3′。扩增反应采用25μl体系： SYBR Green PCR Master Mix 12.5μl，上游引物1μl（10μmol/L），下游引物1μl（10μmol/L），cDNA 5μl，加双蒸水至25μl。反应条件为：模板cDNA 94℃ 4min；94℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 10s，共40个循环；72℃ 7min，在每一循环的退火温度时收集荧光进行实时检测。根据目的基因及36B4扩增标准曲线的Ct值算出基因表达的相对值。 7. 统计学处理：各实验独立重复3次，采用SPSS12.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（x-±s）表示，两组比较使用t检验，P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。 结 果 1. Western blot结果：S6K1 Ax注射db/db糖尿病小鼠肝脏1周后，肝脏S6K1蛋白表达受到抑制，证实基因沉默成功。S6K1 Ax转染AML12细胞后，细胞S6K1蛋白表达也被有效抑制，胰岛素刺激可促使GSK3β表达轻度增强，但S6K1基因沉默和高糖刺激对其表达没有影响，见图1，2。 2. db/db糖尿病小鼠注射S6K1Ax后肝脏占体质量的百分比：对照组肝脏占体质量的百分比为6.79%±0.34%，实验组小鼠为5.45%±0.37%,实验组肝脏占体质量的百分比较对照组明显降低，t＝7.123，P<0.01，差异有统计学意义。 3. db/db糖尿病小鼠注射S6K1Ax后肝脏甘油三酯含量的变化: 肝脏甘油三酯含量对照组为（0.65±0.02）mmol/L，实验组为（0.556±0.01） mmol/L，实验组小鼠肝脏甘油三酯含量明显低于对照组，t＝4.312，P<0.01，差异有统计学意义。 4. 肝脏的病理改变：对照组肝脏呈中度脂肪变性，脂滴分布密度增大，可见大部分肝细胞浆含大脂滴，部分脂滴形成大空泡，将细胞核挤压至一边，肝小叶结构破坏，肝细胞排列不规整，并伴大量肝细胞肿胀，部分呈气球样变。实验组脂肪肝明显改善，胞浆含脂肪滴减少，空泡细胞数量明显减少，肝细胞排列规整，肝细胞肿胀减轻，见图3。 5．逆转录PCR测定AML12细胞SREBP1c、脂肪酸合成酶 (fatty acid synthase, FAS)、葡萄糖激酶（glucokinase, GK） mRNA表达：AML12肝细胞实验显示S6K1基因沉默后，实验组比对照组mSREBP1c、mFAS表达下降，t值分别为5.624和4.564，P值均<0.01。在胰岛素刺激后实验组和对照组mSREBP1c、mFAS表达均较各自基础状态时增加：实验组mSREBP1c上升至0.06±0.02，t＝8.452,P<0.01，mFAS上升至0.28±0.04，t＝5.693, P<0.01, 差异均有统计学意义。但对高糖刺激mSREBP1c、mFAS表达与基础状态时相比无明显改变，t值分别为1.281和1.115，P值均>0.05。S6K1基因沉默对GK表达无影响（t＝1.987，P>0.05）。与基础状态相比，高糖及高胰岛素均可刺激实验组和对照组GK表达的增加：高糖刺激时，实验组上升至1.06±0.06，t＝5.231，P<0.01，高胰岛素刺激时，实验组上升至1.18±0.04，t＝5.781, P<0.01，差异均有统计学意义。与高胰岛素刺激相比，实验组和对照组高糖高胰岛素刺激后mSREBP1c、mFAS、mGK表达无明显差异，见表1（略）。 讨 论 研究表明S6K1不仅参与蛋白合成，在营养过剩时通过负反馈作用引起了胰岛素抵抗，并可能通过某种未知的机制影响脂代谢[3]。Um等[4]研究发现，S6K1-/-小鼠在高脂饮食喂养的情况下，与野生对照小鼠相比体重的增加减少，脂肪储存明显下降。体脂肪指数在S6K1-/-小鼠仅增加了15%～20%，而野生小鼠则增加了2倍，揭示S6K1可能通过某种未知的机制影响了脂肪的合成。王虹剑等[5]的研究也得出S6K1基因c19012T基因型与血脂水平相关的结论。 我们利用RNA干扰技术，将制备的S6K1Ax注入db/db糖尿病小鼠尾静脉，利用腺病毒可特异性作用于肝脏的特性，观察将肝脏S6K1基因沉默后对糖尿病小鼠脂肪肝的影响[6]。S6K 1Ax注射1周后处死小鼠结果显示肝脏占全身体重比值较对照组明显降低，肝脏甘油三酯含量较对照组减少，肝脏HE染色显示S6K1Ax组肝细胞胞浆含脂肪滴减少，空泡细胞数量明显减少，脂肪肝得到改善，支持S6K1参与了脂肪合成的推论。 为研究S6K1通过怎样的机制影响了脂肪合成，我们进行了在小鼠肝脏细胞水平的研究。观察将S6K1基因沉默后对脂肪酸合成起关键作用的SREBP1c及FAS的影响。结果显示在高糖刺激时对AML12细胞mSREBP1c及mFAS的合成没有影响，胰岛素刺激后二者水平上升，与既往研究结果一致，高糖及高胰岛素刺激时mGK表达增加，考虑与增加葡萄糖作用底物有关[7]。将S6K1基因沉默后，与对照组相比肝细胞mSREBP1c及mFAS表达明显下降，支持S6K1通过参与mSREBP1c及mFAS的合成影响了脂肪酸合成的推测。尽管高糖刺激对AML12细胞mSREBP1c及mFAS表达未产生影响，但在活体内血糖水平升高可引起胰岛素的分泌，高糖是否通过刺激胰岛素的分泌间接参与了脂肪酸的合成有待进一步研究。目前的研究结果表明，胰岛素通过PI3K/Akt信号通路调节mSREBP1c的生成而影响脂代谢[8]。PI3K/Akt下游的mTORC1被证实是连接mSREBP1c的一个重要环节，但mTORC1之后的途径目前尚未解明[2]。本研究证实作为mTORC1重要作用底物的S6K1也通过调节mSREBP1c及mFAS的表达参与了脂肪酸的合成，进一步完善了胰岛素影响脂肪酸的信号传导通路。另外研究揭示胰岛素通过PI3K/Akt的激活抑制GSK3β的表达，而GSK3β可与泛素连接酶Fbw7结合后引起mSREBP1的迅速降解从而影响脂肪酸的合成[9-10]。本研究未观察到S6K1基因沉默对GSK3β表达产生影响，故推测S6K1通过影响mSREBP1c及mFAS的合成而非促其降解途径影响了脂肪酸的合成。 据上海流行病学调查显示，上海市成人脂肪肝患病率已达到15.35%，其中大约有50%的人群存在不同程度的糖代谢异常，揭示了脂肪肝与胰岛素抵抗之间的相关性[11]。随着近来对S6K1基因功能认识的不断深入发现，其不仅参与蛋白合成，而且在过度激活的情况下通过负反馈引起胰岛素抵抗[3]。而本研究则进一步揭示S6K1通过对mSREBP1c及mFAS的调节参与了脂代谢。从而明确了S6K1在糖、脂、蛋白三大代谢中的重要作用，为治疗脂肪肝提供了一个新的基因靶目标。 志谢 本研究动物实验部分为研究者2008年6月至8月在日本神户大学医学系研究科春日雅人教授的实验室完成，S6K1Ax及对照病毒由日本神户大学小川涉副教授提供并允许继续使用 参 考 文 献 [1]Wullschleger S, Loewith R, Hall MN. 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