【关键词】 肝功能衰竭，急性；内毒素类；Toll样受体 The role of LPS/TLR4 interaction on the pathogenesis of acute on chronic liver failure DUAN Xue-zhang, WANG Hui-fen. 【Key words】Liver failure, acute; Lipopolysaccharide; Toll-like receptors 【First author’s address】 Liver Failure Treatment and Research Center, the 302nd Military Hospital, Beijing 100039, China Corresponding author: WANG Hui-fen, Email: wanghuifen@ medmail.com.cn 慢加急性肝衰竭（acute on chronic liver failure, ACLF）在临床上仍缺少特异有效的治疗方法[1]。ACLF及其并发症（出血、感染、肝性脑病、肝肾综合征等）是威胁患者生命的重要问题。现对肠道细菌移位（bacterial translocation, BT）过程中脂多糖（LPS）及其配体引起的免疫学变化及其在ACLF中的发病机制研究作一综述。 1. ACLF中的BT与人体免疫：在ACLF的发病过程中，BT是一个重要的病理现象和诱发因素[2]。由于肠黏膜屏障的功能障碍，肠道细菌可通过肠黏膜屏障，移位到达肠系膜淋巴结，甚至通过门静脉系统到达肝脏，对肝脏造成二次打击。个别的病例，细菌可进入血液系统引起败血症，结果是肝脏内的炎症反应持续并失控，甚至出现系统性的炎症反应综合征，导致肝衰竭的发生[3]。在此过程中，肠道细菌（主要为G-杆菌）的LPS与人体免疫细胞表面的Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）相互作用，引起机体全身和肝脏局部免疫系统的变化。因此，LPS/TLR4信号通路在ACLF发病过程中起重要作用，研究此信号通路的作用对阐明ACLF的发病机制，寻找新的治疗方法可提供很大的帮助。 人体的免疫细胞通过Toll样受体（TLRs）来识别微生物。TLRs属于先天免疫的类型识别受体，表达于各种细胞如单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和内皮细胞等。TLRs及其相关的信号途径作为人体的雷达监视系统，能够识别细菌、病毒、真菌、寄生虫等不同微生物表面的病原体相关分子类型。而且，TLRs也能识别人体和其他非微生物类的结构，继而发挥作用。TLRs及其下游信号通路的活化可导致机体内抗微生物的肽类、炎症介质、抗炎症介质的表达（先天免疫），其结果是微生物被消灭、吞噬、凋亡，稍后则发生白细胞的聚集、抗原呈递细胞的抗原提呈和T细胞、B细胞的活化（获得性免疫）。因此，TLRs在人体的先天免疫和获得性免疫中均发挥重要的作用[4]。 2. TLRs的分类、活化与致病机制：TLRs分为两类，一类位于细胞表面，包括TLR4/辅助蛋白（MD）2、TLR1/TLR2和TLR6/TLR2，主要识别外来抗原；另一组位于细胞器的内部，包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9，主要识别微生物的核酸（图1）。不同的TLRs与不同的配体结合，有专一性，如TLR2可识别革兰阳性菌的可溶性肽聚糖（sPGN），TLR4识别革兰阴性菌的LPS，而TLR7和TLR9则分别识别单链RNA和含有寡聚脱氧核酸的DNA片段。TLRs识别配体后，通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖和非依赖两种信号传导途径, 分别激活核因子（NF）-κB和促分裂素原活化蛋白激酶系统的表达, 引起多种细胞因子的释放, 继而激活下游的蛋白分子，然后活化先天性免疫信号，表达各种炎症调节分子，调节各种细胞和组织代谢，而此信号系统的改变可能导致感染和其他疾病的发生。 TLRs的正常活化对于人体预防微生物感染非常重要，过度活化可导致慢性炎症性疾病如糖尿病、肺气肿和其他自身免疫性疾病；活化不足则可能导致许多感染性疾病的发生。因此，能够诱导炎症的TLRs配体可帮助机体清除有害的病原体，而抑制炎症产生的TLRs配体则可治疗某些自身免疫性疾病。目前为止，已将TLRs以及下游的细胞内信号蛋白，作为治疗各种炎性疾病的靶位加以研究，如聚肌胞是TLR3的激动剂，活化TLR3后可用来抗病毒[5]。也开发了许多脂质A的类似物，通过活化TLR4发挥抗细菌和抗病毒的作用[6]。 3. TLR4的活化途径及分子机制：TLR4是人体内最早被鉴定的TLRs。Koziczak-Holbro等[7]发现其结构与果蝇的TLR类似，均为Ⅰ型穿膜蛋白，胞外部分富含亮氨酸重复序列，胞内部分与白细胞介素（IL）-1受体相似。后来的研究证实，TLR4与LPS相互作用，可使细胞内的NF-κB活化。LPS的识别过程至少包括了四个分子的参与，即LPS结合蛋白、CD14、MD2和TLR4，见图2。 LPS结合蛋白和CD14在此过程中主要负责将LPS转运到TLR4/MD2，LPS与TLR4/MD2结合后，可导致TLR4的聚集，然后至少两个胞内信号途径活化，一条途径被称为MyD88依赖的信号途径：在此途径中，至少有两个接头分子即MyD88和包含TIR结构域的接头蛋白参与其中，其结果是转录因子NF-κB的早期活化、炎性细胞因子的分泌和Ⅰ型辅助性T细胞样的细胞反应[8]。另一条途径被称为MyD88非依赖的信号途径，需要Toll样受体接头分子-1和Toll样受体接头分子-2两种接头分子的参与，活化的是干扰素调节因子-3转录因子，结果产生IFNβ[9]。细菌的LPS主要由三部分构成，即脂质A、核心多糖和侧链O。脂质A是内毒素的主要毒性成分，也是诱导TLR4信号通路的主要成分，已被用于疫苗佐剂活化TLR4，人工合成的缺乏脂肪酸的脂质A可作为TLR4的拮抗剂，降低NF-κB的活化和炎症反应。除LPS外，TLR4也能识别一些微生物蛋白如呼吸道合胞病毒的F蛋白。人体内源性的TLR4配体也很多，包括热休克蛋白家族（HSP）22、HSP60、HSP70和糖蛋白96等；许多组织细胞的降解物也与TLR4的配体有相似性，如纤维联结素、透明质烷等。 目前已证实，人体许多疾病如肺炎、冠心病、肾病及糖尿病等，均有LPS/TLR4信号通路的参与。Janardhan等[10]在大鼠的肺炎模型中发现，正常肺组织内检测不到TLR4的mRNA表达，但在气管内加入LPS后，TLR4的mRNA表达增加并持续36h，Western blot也能检测到组织中TLR4蛋白的表达。免疫组织化学可检测到TLR4不仅分布于气管上皮细胞，也分布于血管内皮细胞。Geng等[11]也发现，冠心病患者的外周血单个核细胞表面的TLR4表达增加。 4. ACLF患者LPS与TLR4相互作用的特点及机制：BT过程中，LPS与TLR4相互作用的特点及机制尚不清楚。有观点认为，两者相互作用可导致免疫系统的活化，Paulos 等[12]观察到，放疗引起的胃肠道损伤造成了BT，通过LPS/TLR4通路导致了先天性免疫系统的活化，标志是CD11+ CD86++双阳性的树突状细胞活化，还伴有炎性因子如IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）α的释放，而且，获得性免疫也得到强化。如果用希普欣（喹诺酮类药物）抑制肠道菌群，则树突状细胞的活化和针对肿瘤的免疫功能减弱。Muzio等[13]也发现，LPS能够增加单核细胞甚至多核白细胞表面的TLR4的表达。相反，有人观察到，暴露于LPS的人腹腔内巨噬细胞TLR4的表达水平下降，其功能被抑制至少24h。 在ACLF相关的BT中，LPS与TLR4相互作用引起的免疫学变化及相关临床资料少，且结论尚不一致。如Xing 等[14]对不同阶段ACLF患者外周血与慢性肝衰竭患者进行比较研究，主要研究了单核细胞表面的人白细胞抗原-DR和TLR4表达情况和单核细胞分泌细胞因子的差别。结果发现，与正常人比较，肝硬化、慢加急性肝衰竭患者单核细胞表面的TLR4表达和单核细胞分泌细胞因子（IL-1β、TNFα、IL-12、P70）的功能高于正常人。而Wasmuth等[15]观察到：与稳定的肝硬化患者相比，慢加急性肝衰竭患者与败血症患者的体外产生TNFα水平和单核细胞表面的人白细胞抗原-DR表达水平均明显低于普通肝衰竭组患者。他们认为：ACLF患者和败血症患者均有细胞免疫的缺陷，可能使这类患者增加了感染的机会，造成了高病死率。遗憾的是，他们未进行TLR4表达水平的检测，没有动态的研究，也没有原位肝组织内的研究。 5. 问题与展望：ACLF发病过程中，大量免疫细胞，如单核/巨噬细胞，淋巴细胞，树突状细胞、内皮细胞等参与其中，肝细胞本身也有抗原提呈的作用。在发病过程中，由于肠道BT过程中LPS的作用，可能通过LPS/TLR4信号通路激活机体局部或全身的免疫系统，造成级联放大的免疫活化，最后导致失控的系统性炎症反应综合征。但是，ACLF发生过程中，LPS诱导的TLR4表达水平和活化状态并不清楚，是先过度活化，后抑制？还是先抑制，后活化？也有可能为持续性的抑制或活化？在外周血的抑制或活化状态如何？目前这方面的研究很少，但研究结果对不同阶段的ACLF治疗有重要的指导意义。比如，在慢加急性肝衰竭的早期，如果存在TLR4的活化不足，则可以使用某些上调活化的手段；而后期，如果存在有过度的活化，则可以使用相反的手段进行干预。 LPS/TLR4信号途径在ACLF中的研究较少，有以下原因：（1）缺乏大量、均一的临床病例；（2）细胞表面的TLR4检测需要细胞的分离、纯化、多重标记，技术复杂，试剂和设备昂贵；（3）内毒素的临床检测水平不稳定；（4）简单的ACLF动物模型不能反应人体内复杂的免疫特征及变化；（5）肝组织标本难以获取。上述问题的阐明对于揭示LPS/TLR4信号通路在慢加急性肝衰竭发病过程中的作用，以及为预防其发生和发现新的治疗手段可提供新思路。 参 考 文 献 [1]Liver Failure and Artificial Liver Group, Chinese Society of Infectious Diseases, Chinese Medical Association; Severe Liver Diseases and Artificial Liver Group, Chinese Society of Hepatology, Chinese Medical Association. 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