【摘要】目的 比较50%胎牛血清、油酸分别建立HL-7702细胞脂肪肝的离体细胞模型的优缺点。 方法 采用50%胎牛血清、油酸分别建立HL-7702细胞脂肪肝的离体细胞模型，并用四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性，油红O染色观察细胞内脂滴数量、甘油-3-磷酸氧化酶法检测细胞内甘油三酯含量，比较两种方法的优缺点。两组计量数据比较用t检验，多个样本均数比较采用方差分析。 结果 0.5mmol/ml油酸组和50%胎牛血清组都能建立较好的肝细胞脂肪变性模型，其中0.5mmol/ml油酸诱导的细胞脂变更为明显，细胞内甘油三酯含量为（893.2±89.1）μg/mg，50%胎牛血清组细胞内甘油三酯含量为（411.6±126.6）μg/mg，两组比较，F＝72.288，P<0.01，差异有统计意义。 结论 0.5mmol/ml油酸诱导的肝细胞脂肪变性模型具有实用性和可重复性。该模型为非酒精性脂肪性肝病的研究提供了一条有效、简便、可行的新途径。 【关键词】脂肪肝； 模型，细胞； 油酸； HL-7702细胞 Comparison of two nonalcoholic hepatocellular steatosis models WU Hong-ru, CHEN Shao-hua, LU Yi, LI You-ming. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Corresponding author: LI You-ming, Email: zlym@zju.edu.cn 【Abstract】 Objective To compare two models of nonalcoholic hepatocellular steatosis. Methods HL-7702 cells were incubated with a mixture of of unsaturated oleate acid or 50% fetal bovine serum to induce fat-overloading. Significant fat accumulation was documented by Oil Red O staining , and intracellular triglyceride levels was detected by triglyceride enzymatic assay. Results The results showed that both 0.5 mmol/ml oleate acid and 50% FBS were able to induce nonalcoholic hepatocellular steatosis. Conclusion A nonalcoholic hepatocellular steatosis was induced by 0.5 mmol/ml oleate acid. 【Key words】Fatty liver; Models, cell; Oleic acid; HL-7702 cells 目前，对脂肪肝的研究最常采用的是动物模型[1]。由于动物模型存在个体差异较大，实验条件不易控制，研究周期长，整体影响因素众多等不利因素。而建立细胞模型，能克服个体差异的影响，更好地控制实验条件，而且周期短，能针对性的研究脂肪肝发病的细胞机制，且能进一步缩短药物干预的进程。国内外许多学者利用动物模型、肝细胞模型研究脂肪肝的发病机制、发展、转归、治疗等[2-3]。本实验旨在采用两种方法建立非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型，并比较他们之间的实际操作的可行性和优缺点，为脂肪肝的发病机制和药物研究提供一条有效、简便、可行的新途径。 材料与方法 一、材料和仪器 人正常肝细胞株HL-7702购自中国科学院上海细胞研究所，胎牛血清和1640培养基购自美国Gibco公司，油酸购自美国Sigma公司，甘油三酯（TG）测定试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所，胰酶、四甲基偶氮唑盐（MTT）粉、蛋白定量试剂盒、油红O均购自中国上海生工生物工程技术服务有限公司。生物安全柜购自美国Thermo公司，全自动酶联免疫检测仪购自美国Bio-Rad公司，倒置相差免疫荧光显微镜购自德国徕卡公司。 二、肝细胞脂肪变性模型的建立 1. 细胞培养：HL-7702细胞用含10%胎牛血清的1640培养基培养。当细胞达80%～90%密度时传代，一般3d传1次，每次1传3，细胞生长稳定良好即可使用。取对数生长期细胞接种于6孔培养板进行实验。 2. 油酸造模浓度的确立：用1、0.5、0.25mmol/ml油酸干预后（每组样本数为8），细胞活性变化分别为116.0%和121.5%，对照组为100.0%；A值分别为0.21±0.04、1.24±0.12和1.30±0.19，对照组为1.07±0.19，1mmol/ml油酸对细胞抑制较强，毒性较大，在倒置显微镜下观察发现细胞大量死亡；而0.5mmol/ml油酸和0.25mmol/ml油酸干预的细胞生长良好，并表现出一定的促进生长作用。油红O染色，3种浓度诱导模型均可见细胞内有大量红染的脂滴。选择对细胞活性影响小，不会导致细胞裂解死亡的浓度，所以本实验选择0.5mmol/ml油酸为造模浓度。 3. 细胞诱导分组：将6孔板中培养24h已贴壁的HL-7702细胞分为3组。第1组：对照组（用正常培养基）；第2组：50%胎牛血清培养；第3组：0.5mmol/ml油酸培养。吸去原培养基，各试剂均加4ml，在 三、评价 1. MTT比色法测定细胞活力：将正常培养的肝细胞消化离心，计数后，培养于96孔板中，每孔7000个细胞，第2天分别加入含不同浓度的油酸的培养基及含50%胎牛血清的培养基，置 2. TG测定：将待测细胞种植于6孔板内，胰酶消化收集细胞, 离心并磷酸盐缓冲液冲洗后，加入细胞裂解液, 震荡, 冰上放置30min, 细胞充分裂解后, 3. 油红O染色：肝细胞经诱导48h后，磷酸盐缓冲液洗3次，4%中性甲醛固定15min，加油红O试剂染色15min，60%异丙醇洗3次，苏木素染核5min，洗去染色液后，镜下观察细胞内的脂滴并对脂肪变性的细胞计数。结果判定标准：以细胞质内出现红色的脂滴为脂肪变性细胞。计数100个细胞，半定量分析细胞脂变率，比较两组细胞模型的差距。 四、 统计学处理 实验数据用均数±标准差表示，两组计量数据比较用t检验，多个样本均数比较采用方差分析，统计学处理用SPSS11.5软件，以P<0.05为差异有统计学意义。 结 果 一、细胞形态学观察 倒置显微镜下可见对照组HL-7702细胞排列紧密，边缘清晰。用0.5mmol/ml油酸和50%胎牛血清诱导的HL-7702细胞比对照组的HL-7702细胞明显生长旺盛，边缘尚清晰。油酸组比50%胎牛血清组油腻，且较多细胞变圆，核大，部分细胞核被挤到一侧，类似印戒样改变。 二、细胞内TG含量 对照组、50%胎牛血清组和0.5mmol/ml油酸组细胞内TG含量，分别为（169.0±75.9）μg/mg、（411.6±126.6）μg/mg和（893.2±89.1）μg/mg，油酸组、50%胎牛血清组TG含量比对照组明显升高，F＝72.288，P<0.01，差异有统计学意义。0.5mmol/ml油酸组TG含量比50%胎牛血清组明显升高，说明两种方法诱导的HL-7702细胞脂变均明显，其中油酸组脂变程度更严重。 三、油红O染色显微镜观察结果 对照组未见红染的脂滴；50%胎牛血清、油酸培养的HL-7702细胞呈现明显的肝细胞脂肪变性，胞质内有许多红染的脂滴，油酸干预组更为明显，且大部分细胞变圆，核大，部分细胞核被挤到一侧，类似印戒样改变（图1）。50%胎牛血清组细胞边缘尚清晰，胞质丰富，核膜完整，核大，可见核分裂相，胞质内见明显红染的脂滴，但相对油酸组要少。各组每100个细胞脂变细胞数，对照组为0、50%胎牛血清组为（71.4±4.7）个、0.5mmol/ml 油酸组为（94.6±1.4）个，50%胎牛血清组和0.5mmol/ml油酸组比较，t＝13.433，P<0.01，差异有统计学意义。 讨 论 肝细胞是肝脏的功能细胞，在脂质代谢中的作用举足轻重。 肝细胞对游离脂肪酸的摄入与其存在的浓度差和转运受体有关，而与NAFLD形成有关的、最重要的是血清中游离脂肪酸的浓度[4]。脂肪肝是人体的肝内总脂肪量超过肝重的5%，这种现象的产生是由于进入肝脏的游离脂肪酸，TG的合成和分泌不平衡所造成的[5-6]。油酸与软脂酸是正常人肝脏及NAFLD患者肝脏中存在最普遍的两种脂肪酸[7]。油酸分子式C18H34O2，结构简式CH3(CH2)7 CH=CH(CH2)7COOH,学名顺式-9-＋八(碳)烯。油酸与其他脂肪酸一起，以甘油酯的形式存在于一切动植物油脂中。在动物脂肪中，油酸在脂肪酸中占40%～50%。本实验使用油酸对肝细胞作用，对肝细胞造成慢性损伤，与NAFLD的慢性肝脂变相似[8-9]。同期试验发现而相同浓度的软脂酸毒性大，虽然细胞脂肪发生变性，TG含量仅次于油酸组，但细胞出现大量死亡，在这个浓度下不宜作脂变选择，故本实验没有采用。 目前脂肪细胞的组织学鉴定主要通过苏丹Ⅲ染色或油红O染色。本实验通过油红O染色，结合TG含量的检测来确定肝细胞是否发生脂肪变性。本实验重复多次，结果显示，0.5mmol/ml油酸、50%胎牛血清均能成功诱导肝细胞脂肪变性，且细胞生长良好，重复性好。其中油酸组脂变更为明显，TG检测油酸组比50%胎牛血清组要高得多，且成本相对于50%胎牛血清要低，可作为首选脂变建模方法。脂变诱导过的HL-7702传代后细胞生长缓慢。多次试验发现，HL-7702细胞用10% 1640培养基连续孵育3d，胞质内就会出现细小脂滴，可能为细胞轻微损伤所致。如果继续培养，胞质内的脂滴会逐渐增多，细胞损伤加重，易对脂变诱导模型造成干扰。 50%胎牛血清与油酸干预能有效地建立肝细胞脂肪变性模型，试验条件易于控制，克服了大体动物模型的不足，而且成本低，耗时短，为NAFLD研究提供了重要手段，对于深入研究发病机制及治疗药物的筛选和药效学的研究具有重要意义[10]。 参 考 文 献 [1]Otogawa K, Kawada N. 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