丙型肝炎病毒非结构蛋白5A对干扰素α2b诱导的信号传导和转录激活因子1磷酸化及核转移的影响

 

 

【摘要】  目的  探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A （NS5A）对干扰素α-2b诱导的Janus激酶-信号传导和转录激活子（JAK-STAT）信号传导途径中STAT1磷酸化及核转移的影响。 方法  用表达HCV NS5A的质粒（pCNS5A）转染Huh7细胞，应用免疫细胞化学技术检测HCV NS5A的表达，用免疫荧光和Western blot方法检测HCV NS5A对干扰素α-2b诱导的STAT1磷酸化和核转移的影响。 结果  转染了pCNS5A的Huh7细胞质可见HCV NS5A蛋白的表达；以干扰素α-2b诱导30min后，STAT1磷酸化及核转移在转染了表达HCV NS5A的质粒组比转染空白载体pRC/CMV组及未转染组减少，而未转染组及转染空白载体pRC/CMV组间无明显差别。 结论  表达HCV NS5A的质粒pCNS5A 成功转染至Huh7细胞; HCV NS5A减弱干扰素α-2b诱导的STAT1的磷酸化及核转移，提示NS5A影响干扰素α-2b的JAK-STAT信号传导途径可能是HCV干扰素抵抗的机制之一。

【关键词】  肝炎病毒，丙型； 病毒非结构蛋白质类； 干扰素α；信号传导

 

【Abstract】    Objective    To study the effect of HCV NS5A on the Janus kinase (JAK)/signal transducer and activation of transcription (STAT1) phosphorylation and translocation induced by IFNα-2b and to understand the possible molecular mechanism of HCV interferon resistance. Methods    Hepatocellular carcinoma cell line Huh7 was transiently transfected with HCV NS5A protein expression plasmid pCNS5A and blank plasmid pRC/CMV respectively; the cells of the same cell line, without transfection, served as controls. Immunocytochemistry was used to prove the successful transfection. Immunofluorescence and Western blot were performed to observe the difference in STAT1 phosphorylation and nuclear translocation between HCV NS5A-expressed and non-HCV NS5A-expressed cells after 30 minutes of IFNα-2b induction. Results    HCV NS5A protein was detected in the cytoplasm of Huh7 cells transfected with pCNS5A, indicating the successful transfection.  In comparison to the blank plasmid-transfected and non-transfected group, STAT1 phosphorylation and sequential nuclear import were reduced in the presence of HCV NS5A protein. Conclusion    HCV NS5A can, to some extent, inhibit phosphorylation and nuclear translocation of STAT1 in IFNα-2b-induced JAK/STAT pathway, which may be a possible mechanism of HCV interferon resistance.

【Key words】     Hepatitis C virus;   Viral nonstructural proteins;   Interferon alpha;   Signal transduction

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（nonstructural protein 5A，NS5A）作为HCV非结构蛋白之一，在干扰素（IFN）疗效预测、病毒复制、抗病毒抗性、肝细胞癌发生等方面均具有重要作用。Janus激酶-信号传导和转录激活子（Janus kinase-signal transduction and activators of transcription，JAK-STAT）信号传导系统是IFN介导的信号传导和转录激活的主要方式。STAT1是STAT反式作用因子家族的一员， 通常情况下主要以非活化单体形式存在于细胞质中，IFNα与受体结合后STAT1的701位酪氨酸残基被磷酸化形成二聚体移入核内，转录激活IFN刺激基因如双链RNA依赖的蛋白激酶(dsRNA-dependent protein kinase，PKR)、MxA、半乳糖结合蛋白等表达，产生抗病毒效应，其中任意环节受损都可能导致IFN抗病毒效应受损。有研究表明NS5A抑制PKR从而降低IFN抗HCV效应[1-3]。而STAT1是JAK-STAT信号传导途径上游的关键分子，我们通过研究NS5A对IFNα-2b诱导的STAT1磷酸化及核转移的影响，探讨HCV抗IFN抗性可能存在的其他分子机制。

材料与方法

1. 细胞株和质粒：人肝癌细胞株Huh7由本中心保存。将细胞种植于含体积分数10%胎牛血清(购自天津灏阳公司)的DMEM培养液中常规培养。pCNS5A 为含HCV NS5A cDNA的真核表达载体，在美国科罗拉多大学完成并通过序列分析证实[4]，空白载体pRC/CMV由美国Siddiqui教授惠赠。

2. 试剂：脂质体LipofectmineTM2000购自美国Invitrogen公司。IFNα-2b（哈药集团生产）、丙型肝炎患者血清、兔抗人抗-STAT1抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG均购自武汉博士德公司，兔抗人抗-磷酸化STAT1（Tyr701，酪氨酸701）购自美国Cell Signalling Technology公司，兔抗人肌动蛋白抗体购自美国Santa cruz公司，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自美国KPL公司，硝酸纤维素膜购自德国Schleicher&Schuell公司。

3. 质粒转染：将Huh7细胞以1×105密度种植，按LipofectmineTM2000说明书中的转染程序，分别将pCNS5A和pRC/CMV导入细胞,12h后换培养液,48h后进行下一步实验。

4. 免疫细胞化学和免疫荧光：转染48h后对各组细胞进行免疫细胞化学实验（间接法,DAB显色）检测HCV NS5A的表达，第一抗体浓度1∶20，第二抗体浓度1∶100。转染48h后各组细胞分别加IFNα-2b 10000U/ml，30min后用免疫荧光法（间接法，FITC）分别检测转染了pCNS5A细胞的STAT1和磷酸化STAT1（Tyr701）蛋白，将转染pRC/CMV组和未转染组作为对照。第一抗体浓度均为1∶100，第二抗体浓度为1∶15。

5. Western blot: 分别对转染pCNS5A和pRC/CMV细胞以及未转染组细胞用IFNα-2b诱导30min，胰酶消化细胞，按如下方法提取总蛋白质：在4℃条件下，按5×106个细胞加100μl含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液[150mmol/L NaCl、1mmol/L EGTA、1mmol/L NaF、50mmol/L Tris-HCl（pH7.4）、 1% NP-40、0.1mmol/L NaN3、 50μg/ml苯甲基磺酰氟］；在冰上反应30min后，12000r/min 4℃离心10min，收集上清液；Bradford法测蛋白质浓度。取蛋白质各100μg，不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，100V、100min湿法电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭；加第一抗体（兔抗人抗－磷酸化STAT1，兔抗人肌动蛋白抗体）4℃过夜，磷酸盐缓冲液漂洗3次；加第二抗体室温1h，磷酸盐缓冲液漂洗3次，DAB显色。

结    果

1. 免疫细胞化学分析HCV NS5A在Huh7细胞内的表达：转染了pCNS5A质粒的细胞内有HCV NS5A表达，棕黄色颗粒分布于细胞质中。转染pRC/CMV组和未转染组则未见DAB显色，无HCV NS5A表达（图1）。

2. 免疫荧光分析HCV NS5A对IFNα－2b诱导的STAT1磷酸化和核转移的影响：JAK－STAT信号传导途径被IFN激活后，游离于细胞质中的STAT1在短时间内磷酸化并转移至核内。检测STAT1的免疫荧光实验结果显示，转染pRC/CMV组和未转染组大部分细胞核阳性（绿色荧光），细胞质无荧光染色（图2B和2C）；转染pCNS5A质粒组的细胞核大部分阴性而细胞质阳性（图2A）,表明HCV NS5A能抑制IFNα－2b诱导的STAT1核转移。检测磷酸化STAT1（Tyr701）的免疫荧光实验显示，转染pRC/CMV组和未转染组大部分细胞核阳性，细胞质无荧光染色（图2E和2F）；转染pCNS5A质粒组的细胞核大部分阴性且细胞质亦阴性（图2D），表明HCV NS5A能抑制IFNα－2b诱导的STAT1磷酸化及核转移，空质粒对其无影响。

3. Western blot分析HCV NS5A对IFNα－2b诱导的STAT1磷酸化的影响:转染pCNS5A质粒组磷酸化STAT1表达低于转染pRC/CMV组和未转染组（图3），后两组间无差别。进一步印证了免疫荧光实验的结果，说明HCV NS5A对STAT1磷酸化有抑制作用。

讨    论

目前的研究表明HCV NS5A具有抗凋亡功能、与PKR的结合活性、转录激活作用、干扰细胞内信号传导通路、调节病毒的复制水平、诱导钙释放以及诱导白细胞介素－8的产生等多项生物学活性，提示其在病毒持续感染和肝细胞癌发生中可能具有重要作用。

自从Enomoto等[5]报道HCV NS5A与IFN疗效相关联以来，已经有一系列的研究表明HCV NS5A对IFN疗效的影响存在多种机制，可能包括干扰素敏感决定区突变[5]、对PKR的抑制[1-3]、直接和间接干扰细胞信号传导途径[6,7]、与2′～5′寡腺苷酸合成酶的相互作用[8]以及V3区突变[9，10]等。JAK－STAT信号传导系统是IFN介导信号传导和转录激活从而产生抗病毒效应的主要方式，而STAT1是该途径中的关键分子，起着分子信使的作用。STAT1初始位于细胞质，当它被磷酸化（Tyr701）激活后，二聚体化，构象改变使得入核信号暴露而被专有入核载体importin α5识别。在细胞核内，STAT1二聚体与入核载体脱离并且结合到调节基因启动子的特异性靶位点，转录激活表达抗病毒蛋白。随后在核内被酪氨酸磷酸酶去磷酸化，从DNA上脱离下来与CRM1出核载体结合并转出至细胞质。STAT1的入核跟随后的出核这一循环对于信号传导和转录活化功能是必须的。这种STAT1循环迅速开始于诱导后数秒内，15～30min达到高峰，数小时后STAT1重新分布至细胞质[11]。我们的研究显示，与不表达HCV NS5A组比较，瞬时转染HCV NS5A表达质粒的Huh7细胞中，IFNα－2b诱导30min时磷酸化状态的STAT1蛋白量下降且转移至细胞核内的STAT1减少，说明HCV NS5A对STAT1分子磷酸化活化及核转移有抑制作用，从而干扰IFNα－2b诱导抗病毒信号传导途径。这可能是HCV IFN抗性的分子机制之一。而这种抑制作用通过哪一个或多个环节实现？HCV NS5A是否结合STAT1起到“屏蔽”作用？HCV NS5A是否下调STAT1的表达？是否存在对更上游分子的抑制？另外，磷酸化STAT1入核需要载体importinα5参与，NS5A减少磷酸化STAT1入核机制中是否也包括与importinα5的相互作用？这些问题还需要继续研究。

在临床工作中，部分丙型肝炎患者对IFNα治疗耐药，而部分仍然敏感，似乎与我们的实验结果有出入。事实上，HCV易变异，位于HCV NS5A的干扰素敏感决定区以及V3区变异都与IFN疗效有关。干扰素敏感决定区的氨基酸变异数大于4者称为突变型，突变型HCV对IFN治疗敏感，而野生型对IFN有抗性[5]；亦有研究显示V3区突变数可能与IFN疗效呈正相关[12]。我们导入细胞所表达的正是野生型HCV NS5A，我们的研究结果不但与临床实际不相矛盾，而且可在一定程度上解释“部分敏感、部分耐药”的现象。IFN诱导的信号传导途径错综复杂，而我们所研究的只是其中的一个环节，对IFN疗效的影响机制及其效应，应当是多因素相互影响的综合体现。

HCV NS5A的功能尚未完全明确，其对IFN疗效的影响存在多种机制，但目前仍存在一定的争议，是否还有另外更加起主导作用的机制，有待进一步深入探讨。

志谢  苏先狮教授、肖新强、邓春明老师对实验工作的支持与指导，湘雅二医院肝病研究中心蒋永芳老师、王文龙老师的热情帮助

参  考  文  献

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2He Y, Katze MG. To interfere and to anti-interfere: the interplay between hepatitis C virus and interferon. Viral Immunol, 2002, 15: 95-119.

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5Enomoto N, Sakuma I, Asahina Y, et al. Comparison of full-length sequences of interferon-sensitive and resistant hepatitis C virus 1b. Sensitivity to interferon is conferred by amino acid substitutions in the NS5A region. J Clin Invest, 1995, 96: 224-230.

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