【关键词】 环氧合酶-2； 肝肿瘤； 治疗学 The effects of refecoxib on inhibiting the growth and inducing apoptosis of hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 and human normal liver cell line QSG7701 SHEN Wei-dong, LIU Peng-fei. 【Key words】 Cyclooxygenase-2; Liver neoplasms; Therapeutics 【First author抯 address】 Department of Digestive Diseases, Affiliated Jiangyin Hospital, Southeast University, Jiangyin 214400, China Email: shenwd2003@yahoo.com.cn 有研究表明，在肝癌组织中环氧合酶-2（COX-2）表达明显上升，COX-2的异常表达与肝癌的发生、进展有着重要的关系[1]。但对于COX-2抑制剂在临床上用于治疗肝癌的报道鲜见。罗非昔布（refecoxib）是一种特异的COX-2抑制剂。本研究以不同浓度的罗非昔布作用于人肝癌细胞株HepG2和人肝细胞株QSG-7701，并进行对比分析，探讨其对肝癌细胞生长及凋亡的影响，同时探讨其对正常肝细胞的影响，为评价它用于临床治疗肝癌的有效性和安全性提供理论依据。 一、 材料与方法 1.材料：人肝癌细胞株HepG2和人肝细胞株QSG-7701均购自中国科学院上海细胞生物研究所。罗非昔布为默沙东公司产品。细胞培养基RPMI 1640为美国Gibco公司产品。四甲基偶氮唑盐（MTT）为上海华舜生物工程有限公司产品。单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司。 2. 细胞培养：每48～72h用0.25%胰酶消化，1∶2～1∶4扩瓶传代。细胞用含体积分数10%小牛血清及1%双抗(抗青霉素和抗链霉素)的RPMI 1640培养液常规培养。 3. MTT法检测细胞的抑制率：取对数生长期的HepG2、QSG-7701细胞以4×103/孔传入9孔培养板，孵育24h后每孔加入不同药物浓度（0.1、1.0、10μmol/L）的罗非昔布100μl（对照组中加等量等渗盐水，选药浓度依据为其血药峰值浓度的0.1～10倍），分别于加药后12、24、48、72h检测细胞活力。按公式“细胞增殖抑制率（%）＝1－实验组A值／对照组A值×100%”计算不同药物浓度和作用不同时间的罗非昔布对细胞的增殖抑制率。 4. 流式细胞仪检测细胞凋亡：常规消化不同浓度、作用不同时间的细胞,离心收集固定后的细胞,用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。加入500μl结合缓冲液重悬细胞，立即加入AnnexinⅤ-异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）各5μl，100μｇ/ml的核糖核酸酶A的溶液中重悬细胞沉淀, 流式细胞仪检测细胞凋亡率。 5. 免疫细胞化学检测：用罗非昔布作用不同时间的HepG2、QSG-7701细胞分别涂片，晾干，95%乙醇固定，PBS冲洗，再滴加正常非免疫动物血清。接着分别加Bcl-2和Fas的第一抗体、第二抗体，二氨基联苯胺（DAB）染色，苏木素复染，PBS冲洗，光学显微镜下计数。表达强度的判断：Bcl-2、Fas基因表达阳性表现为细胞质黄褐色染色。选取连续5个视野（×400）作为观察区，求5个视野内阳性细胞数的平均值。Bcl-2和Fas基因阳性表达的标记指数（LI）根据以下公式计算：LI=阳性细胞数/计数细胞总数×100%。 6. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测：取处于对数生长期的HepG2及QSG-7701细胞，提取细胞总RNA，合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增、电泳。将含有产物条带的电泳图谱扫入电脑，以“凝胶分析软件”对条带进行分析，读取其积分吸光度值，以Bcl-2和Fas平均积分吸光度值/β-肌动蛋白平均积分吸光度值来表示相对表达强度。其中引物根据Bcl-2和Fas基因自行设计，由上海申能博彩生物工程公司合成，预期产物大小为298、316bp。Bcl-2引物序列上游：5′-GGATG TTCTGTGCCTGTAA-3′，下游：5′-TTCTCAACCCTTG AAGTCTA-3′；Fas引物序列上游：5′-GCCATAAGCC CTGTCCTC-3′，下游：5′-TGAGTGGTCGTTGTGGTT-3′。 7. 统计学分析：数据由WStata统计软件进行方差分析。 二、结果 1. 罗非昔布对HepG2和QSG-7701细胞增殖的影响：罗非昔布对HepG2细胞表现出增殖抑制作用，且随着药物浓度的提高，对HepG2细胞增殖抑制作用相应地增强，各药物浓度组比较差异有统计学意义（F≥9.52，P<0.05）；同时，随着作用时间的延长，抑制作用也明显增强（F≥10.51，P<0.05），见表1。而对QSG-7701细胞增殖则无明显影响（P>0.05）。 2. 流式细胞仪检测结果：随着罗非昔布浓度的增高，HepG2细胞凋亡率增高（F≥9.85，P<0.05），存在着量效关系；随着作用时间的延长，HepG2细胞凋亡率逐渐升高，存在着时效关系(图1，表2)。而对QSG-7701细胞凋亡率则无明显影响。 3. Bcl-2和Fas蛋白质的表达情况：免疫细胞化学检测1.0μmol/L罗非昔布对HepG2和QSG-7701细胞表达Bcl-2和Fas蛋白质的影响（表3）。HepG2细胞的Bcl-2和Fas表达的标记指数各时间点相比，差异均有统计学意义（F≥4.51，P<0.05），且随着时间的延长，Bcl-2的表达逐渐减弱，Fas的表达逐渐增强（图2，图3）。各时间点的Bcl-2和Fas表达的标记指数与肝细胞QSG-7701相比，差异均有统计学意义（t≥3.95，P<0.05）。而QSG-7701细胞的 Bcl-2和Fas表达的标记指数各时间点相比，差异无统计学意义。 4. RT-PCR检测结果：在用1.0μmol/L罗非昔布作用12、24、48、72h，HepG2细胞的Bcl-2 mRNA表达逐渐下降（F＝351.42，P<0.05），Fas mRNA表达逐渐上升（F＝251.40，P<0.05），见表4，图4。 三、讨论 有研究也表明，COX-2抑制剂有一定的抗肿瘤作用，能够抑制肝癌细胞的生长。但其抗肿瘤的机制尚不清楚[1-3]。本研究MTT实验证实，罗非昔布可抑制肝癌细胞的增殖，且随着浓度的增高、时间的延长，其作用越强，呈明显的剂量-效应、时间-效应关系。流式细胞仪定量分析进一步从分子水平检测细胞凋亡发生的程度,显示罗非昔布浓度越高，凋亡指数越高，诱导细胞凋亡作用越强;与MTT法中细胞生长抑制率与浓度、时间的依赖关系相同。研究结果表明罗非昔布能抑制人肝癌细胞生长和诱导其凋亡，与国外有关研究结果相一致[4，5]。 同时，本研究通过免疫细胞化学和半定量PCR也发现，随着罗非昔布作用于肝癌细胞时间的延长，细胞凋亡增加，同时也伴随Bcl-2（抗凋亡基因）表达下调和Fas（促凋亡基因）表达的增强，提示Bcl-2和Fas可能参与了罗非昔布诱导肝癌细胞凋亡的信号途径。Sheng等[6]研究证实，COX-2基因表达及其产物前列腺素E2能够促进凋亡抑制基因Bcl-2的表达并引起细胞凋亡减少。通过阻断COX-2途径能抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，其凋亡机制可能是上调促凋亡基因Fas的表达，下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，使Fas/Bcl-2比例上升。 目前对于选择性COX-2抑制剂对肝癌细胞的影响仅限于基础研究，为进一步验证其用于临床的可行性及对正常肝细胞有无影响，本研究对人肝细胞和人肝癌细胞进行了对比研究。结果显示，一般剂量的罗非昔布在抑制肝癌细胞的增殖、诱导凋亡的同时，对人肝细胞的影响较小；且随着罗非昔布浓度的增加、作用时间的延长，对人肝细胞的影响差异无统计学意义。Tai等[7]研究表明，在肝癌细胞中存在核因子-κB的活化，活化的核因子-κB上调COX-2的表达，进一步促进肿瘤血管的生成、肝癌细胞的增殖，而正常肝细胞中COX-2表达较低。罗非昔布通过选择性抑制COX-2，可以抑制肝癌细胞的增殖，而对正常肝细胞影响相对较小。因此，我们认为，选择性COX-2抑制剂罗非昔布是相对安全、有效的抗肝癌药物。 参 考 文 献 1Tang TC, Poon RT, Lau CP, et al. Tumor cyclooxygenase-2 levels correlate with tumor invasiveness in human hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 2005, 11: 1896-1902. 2Bae SH, Jung ES, Park YM, et al. Expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) in hepatocellular carcinoma and growth inhibition of hepatoma cell lines by a COX-2 inhibitor, NS-398. Clin Cancer Res, 2001, 7: 1410-1418. 3Chi-Man Tang T, Tung-Ping Poon R, Fan ST. The significance of cyclooxygenase-2 expression in human hepatocellular carcinoma. Biomed Pharmacother, 2005, 59 Suppl 2: S311-316. 4Liu NB, Peng T, Pan C, et al. Overexpression of cyclooxygenase 5Lampiasi N, Fodera D, D'Alessandro N, et al. The selective cyclooxygenase-1 inhibitor SC-560 suppresses cell proliferation and induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Mol Med, 2006, 17: 245-252. 6Sheng H, Shao J, Morrow JD, et al. Modulation of apoptosis and Bcl-2 expression by prostaglandin E 7Tai DI, Tsai SL, Chang YH, et al. Constitutive activation of nuclear factor kappaB in hepatocellular carcinoma.Cancer, 2000, 89: 2274-2281.
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