【摘要】 目的 观察peroxiredoxinⅡ（PrxⅡ）mRNA和蛋白在黄曲霉毒素B1（AFB1）诱发树鼩HCC形成过程中的表达变化，并在人肝癌癌旁组织和正常肝组织中进行验证，以探讨PrxⅡ在肝癌形成过程中的作用。 方法 应用RT-PCR和Western blot方法，检测6例AFB1诱发的树鼩肝癌、癌旁组织和这些动物肝癌发生前的活检肝组织，以及6例对照组动物相应时期的肝活检组织PrxⅡ在mRNA水平和蛋白水平的表达情况，并在18例人肝癌及其相应癌旁组织以及17名正常人肝组织进行验证。 结果 PrxⅡ在树鼩肝癌组织中的mRNA和蛋白质表达水平均明显高于相应的癌旁和癌前组织，也高于对照组同期活检肝组织（P＜0.05）；人肝癌组织中PrxⅡ的mRNA和蛋白表达改变和树鼩相符，即肝癌中的表达高于癌旁组织和正常肝组织（P＜0.05）。 结论 PrxⅡ基因可能与肝癌的发生发展有关，并有可能成为防治肝癌的分子靶标。
【关键词】 过氧化物酶体类； 癌，肝细胞； 黄曲霉毒素B1； 树鼩
The expression of peroxiredoxin II in hepatocellular carcinoma and its significance YUE Hai-ying*, CAO Ji, CUI Jie-feng, DAI Zhi, SU Jian-jia, DUAN Xiao-xian, YANG Chun, YUE Hui-fen, LI Yuan, LIU Yin-kun. *Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
Corresponding author: LI Yuan, Email: li-yuan@ public.nn.gx.cn
Co-corresponding author: LIU Yin-kun, Email: ykliu@ zshospital.com, Liver Cancer Institute, Affiliated Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai 200032, China
【Abstract】 Objective To evaluate the mRNA and protein expressions of peroxiredoxin II (PrxII) in hepatocellular carcinoma (HCC) and their significance. Methods HCC was induced by aflatoxin B1 (AFB1) in 6 tree shrews (Tupaia belangeri chinensis). The expression levels of PrxII mRNA and protein were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot on HCC tissues and on their surrounding liver tissues (para-HCC). Biopsied liver tissues were taken before the HCC induction (pre-HCC) from the same animals and from a group of blank controlled animals that served as controls. Liver biopsy specimens from 18 cases of human HCC and from 17 healthy human volunteers were studied using the same methods. Results The mRNA and protein expressions of PrxII in tree shrew HCC tissues were significantly higher than those in para-HCC and pre-HCC tissues, and also higher than those in the liver tissues from the control animals (all P < 0.05). The expression levels of PrxII mRNA and protein in human HCC tissues were also significantly higher than those in their para-HCC tissues and in the human normal liver tissues (P < 0.05). Conclusion PrxII might play an important role in hepatocarcinogenesis and might be used as a molecular target for HCC prevention and treatment.
【Key words】 Peroxisomes; Carcinoma, hepatocellular; Aflatoxin B1; Tree shrew
HCC是常见并且危害严重的恶性肿瘤之一，我国占全世界每年发病人数的近50%[1]。近20年来，我国HCC发病率呈上升趋势，其病死率占全部恶性肿瘤病死率的18.8%，仅次于胃癌，居第二位[2]。迄今为止，HCC发生发展的分子机制还不十分清楚。应用低等灵长类动物树鼩肝癌模型，我们在前期研究中用比较蛋白质组学技术对黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）诱发树鼩肝癌过程中的蛋白表达改变进行了动态观察，筛选出一组与肝癌发生发展有关的差异表达蛋白，其中peroxiredoxin Ⅱ（PrxⅡ）基因的蛋白表达水平在树鼩肝癌形成过程中呈现逐步升高的趋势[3]。本研究通过RT-PCR和Western blot技术，分别观察了PrxⅡ的mRNA表达水平和蛋白表达水平在树鼩肝癌形成过程中的动态变化，并在人肝癌组织进行验证，以探讨PrxⅡ在肝癌发生发展中的意义。
材料与方法
1. 动物实验及肝组织标本的获取：购自中国科学院昆明动物研究所的成年雄、雌性树鼩随机分为实验组和对照组。实验组喂予AFB1诱发肝癌，对照组按正常饲养方法喂养。实验期间定期对各组动物进行剖腹手术取肝组织；动物发生肝癌后以颈椎脱臼法处死，取肝癌和癌旁组织。所有肝活检组织及肝癌、癌旁组织均经液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。本研究从实验组选取6例肝癌及其相应癌旁组织以及这些动物肝癌发生前即实验第45周、第75周的活检肝组织（肝癌主要发生于实验第105周前后）；选取对照组6例动物的第45周、75周和105周的肝活检组织作正常同期对照组织。
2. 人肝组织标本：18例人肝癌组织和相应的癌旁组织（距离肿瘤边缘2cm以外）取自广西医科大学附属肿瘤医院2003年7月－2004年7月肝胆外科手术切除标本。其中女4例，男14例；年龄25～72岁，平均（49.5±11.7）岁；所有患者术前均未接受化、放疗或生物治疗等干预措施。17例正常肝组织来自广西医科大学第一附属医院普通外科手术标本，其中肝血管瘤7例、肝胆管结石症10例。
3．试剂：AFB1为美国Sigma公司产品；Trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录酶、10mmol/L dNTP、Taq DNA聚合酶均为MBI公司产品；Oligo(dT)18、RNase抑制剂、Lowry法蛋白浓度检测试剂盒均购自上海申能博彩生物科技有限公司；PVDF膜、ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司；兔抗人PrxⅡ多克隆抗体购自韩国Lab Frontier公司；小鼠抗人β-actin多克隆抗体购自美国Neomarker公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG分别购自北京中山生物试剂公司和美国PKL公司。
4．RT-PCR：用Trizol提取组织总RNA，紫外分光光度计测吸光度（A）值，以A260/A280＝1.8～2.0为RNA质量判断标准。逆转录反应体系含总RNA 3μg，Oligo(dT)18 0.5μg，10mmol/L dNTP 2μl，RNase抑制剂20U，逆转录酶200U，总体积为20μl。逆转录完毕后70℃变性10min，冰上冷却后-20℃冰箱保存备用。PrxⅡ引物设计为通过Blast对比，选取人、鼠同源的序列，由上海生工生物公司合成，其上、下游引物序列分别为5′-CAG TGATGGCCTCCGGTAACG-3′和5′-AGGT GGGTGAACTGAGAGTCC-3′，扩增片段长度为265bp。GAPDH的上、下游引物序列分别为5′-TCATTGACCTCAACTACATG-3′和5′-GCAGT GATGGCATGGACTGT-3′，扩增片段长度为439bp。引物先稀释为10pmol/L，然后按25μl的反应体系进行PCR扩增：94℃变性5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s，30个循环；72℃延伸7min。PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析系统进行半定量分析。
5．Western blot：每40～80mg组织加裂解液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4% CHAPS、20mmol/L Tris、1mmol/L PMSF、2% pharmylte、65mmol/L DTT）600～800μl，冰浴制匀浆，低温离心后吸取上清液，Lowry法进行蛋白质定量。取蛋白质样品各40μg经12.5%的SDS-PAGE电泳，稳压（10V）转至PVDF膜，于摇床上以5%脱脂奶粉室温封闭1h。加1∶2000稀释的兔抗人PrxⅡ多克隆抗体和作为内参照1∶400稀释的小鼠抗人β-actin多克隆抗体，室温孵育2h，TBST洗膜后，分别加入相应的1∶5000稀释的HRP标记第二抗体室温孵育1h。最后用ECL化学发光试剂盒检测。
6．统计学处理：应用SPSS10.0软件对数据进行统计学处理。实验数据用均数±标准差表示。应用配对t检验和成组设计t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
结 果
1．PrxⅡ mRNA在树鼩和人肝癌组织中的表达：RT-PCR检测树鼩和人肝组织标本中PrxⅡ表达情况见图1，2；扩增产物经凝胶成像系统半定量分析的结果见图3，4。在第45、75周和105周时，对照组PrxⅡ mRNA表达水平分别为0.64±0.24，0.54±0.17和0.64±0.24；实验组PrxⅡ mRNA表达水平在第45和75周时分别为0.60±0.22和0.62±0.18，在第105周时，肝癌组织为1.71±0.71，癌旁组织为0.50±0.14。实验组第105周时树鼩肝癌组织的PrxⅡ mRNA表达水平明显高于同组的癌旁组织、第45周和75周时的肝组织，差异有统计学意义（t值分别为3.66，2.95和3.16，P值均＜0.05）；也高于对照组第45、75周和105周时的肝组织，差异有统计学意义（t值分别为3.20，3.58和3.19，P值均＜0.05）。PrxⅡ mRNA在人肝癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达水平分别为0.86±0.20，0.74±0.23和0.66±0.24，癌组织明显高于癌旁组织和正常肝组织，差异有统计学意义（t值分别为2.76和2.68，P值均＜0.05）。
2．PrxⅡ蛋白水平在树鼩和人肝癌组织中的表达：Western blot检测树鼩和人肝组织标本的PrxⅡ蛋白表达情况见图5，6。图5显示PrxⅡ蛋白表达水平在树鼩肝癌的形成过程中呈现逐步增加的趋势，图6显示PrxⅡ蛋白在人肝癌组织中的表达水平高于癌旁和正常肝组织。
讨 论
PrxⅡ属于新近发现的一类过氧化物酶peroxire-doxins（Prxs）家族的一员。Prxs参与细胞的增殖与分化、抗氧化损伤、细胞凋亡和信号传导等多种功能活动，广泛存在于原核生物和真核生物中[4]。哺乳动物的Prxs家族有PrxⅠ～Ⅵ 6个成员，这些成员根据它们之间氨基酸序列的同源性和半胱氨基酸残基（Cys）数目的不同分为2-Cys Prx、非典型2-Cys Prx和1-Cys Prx 3个亚类，其中PrxⅡ属于2-Cys Prx[5]。2-Cys Prx亚类的成员含两个高度保守的具有氧化还原活性的半胱氨酸残基，即过氧化活性的半胱氨酸残基（Cys51）和还原活性的半胱氨酸残基（Cys172）[6, 7]。在发挥抗氧化作用时，一条肽链上的Cys51巯基与另一肽链上的Cys172巯基之间脱氢形成分子间二硫键，以硫氧还原蛋白为供氢体来还原过氧化物或超氧化物，并通过调节过氧化氢的水平参与细胞信号传导[8,9]。
活性氧在体内的致癌作用已为越来越多的研究所证实，而Prxs的主要功能是抗氧化和清除自由基，故Prxs与恶性肿瘤的关系日益受到重视。据报道，PrxⅡ的表达在乳腺癌[10]、恶性间皮瘤[11]、肺癌[12]、结肠癌细胞系HCT-116[13]和肾癌[14]均明显增高。此外，还有一些研究结果提示PrxⅡ在肿瘤放疗或化疗中的辅助作用：Yo等[15]发现转染PrxⅡ基因的反义核酸可促进抗肿瘤药物顺铂诱导的细胞凋亡，Park等[16]报道PrxⅡ在对放疗具有抗性的肿瘤细胞中高表达并且其高表达可以抑制或减少电离辐射诱导的细胞凋亡。目前尚不清楚PrxⅡ在恶性肿瘤组织中高表达的确切机制，有研究表明将细胞快速置于亚致死的氧化状态下并不能引起PrxⅡ的明显增加或降低，但若置于严重的氧化状态下则可导致PrxⅡ增加、过氧化作用加剧和细胞内氧化还原状态改变[17]，提示PrxⅡ在恶性肿瘤中的高表达可能和肿瘤组织微环境内的慢性持久的氧化状态有关。
本研究通过观察AFB1诱发树鼩肝癌形成过程中PrxⅡ基因在mRNA水平和蛋白水平的表达变化情况，并在人肝癌组织进行验证，发现PrxⅡ mRNA和PrxⅡ蛋白质表达水平在树鼩和人肝癌组织中均明显增高。同时，本研究还发现PrxⅡ的表达水平在树鼩肝癌形成过程中有逐渐升高的趋势：PrxⅡ在实验组第45和75周活检肝组织中的mRNA表达水平和蛋白质表达水平均低于其相应的肝癌组织，并且实验组45周的表达水平还略低于实验组75周，提示PrxⅡ的表达水平上调可能是肝癌发生的早期事件。
总之，本研究结果验证了本项目前期研究中应用比较蛋白质组学技术筛选肝癌相关差异表达蛋白的结果，也提示PrxⅡ在肝癌的形成过程中可能起重要作用，有可能成为防治肝癌的分子靶标。对PrxⅡ在肝癌形成中的生物学功能和作用机制，我们将在本项目的后续研究中进一步探讨。
参 考 文 献
[1]Regimbeau JM, Farges O, Shen BY, et al. Is surgery for large hepatocellular carcinoma justified? J Hepatol, 1999, 31: 1062-1068.
[2]Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin, 2005, 55: 74-108.
[3]Qin X, Dai Z, Cui JF, et al. Differentlly expressed proteomics during hepatocarcinogenesis of tree shrew induced by aflatoxin B1. Zhonghua Jianyan Yixue Zazhi, 2006, 29: 538-542.
秦雪,代智,崔杰峰,等.黄曲霉毒素B1诱发树鼩肝癌过程中的差异表达蛋白质分析及意义.中华检验医学杂志,2006,29:538-542.
[4]Chae HZ, Robison K, Poole LB, et al. Cloning and sequencing of thiol-specific antioxidant from mammalian brain: alkyl hydroperoxide reductase and thiol-specific antioxidant define a large family of antioxidant enzymes. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 7017-7021.
[5]Chang TS, Jeong W, Choi SY, et al. Regulation of peroxiredoxin I activity by Cdc2-mediated phosphorylation. J Biol Chem, 2002, 277: 25370-25376.
[6]Wood ZA, Schroder E, Robin Harris J, et al. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends Biochem Sci, 2003, 28: 32-40.
[7]Schroder E, Littlechild JA, Lebedev AA, et al. Crystal structure of decameric 2-Cys peroxiredoxin from human erythrocytes at 1.7 A resolution. Structure, 2000, 8: 605-615.
[8]Rabilloud T, Heller M, Gasnier F, et al. Proteomics analysis of cellular response to oxidative stress. Evidence for in vivo overoxidation of peroxiredoxins at their active site. J Biol Chem, 2002, 277: 19396-19401.
[9]Wood ZA, Poole LB, Karplus PA. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science, 2003, 300: 650-653.
[10]Karihtala P, Mantyniemi A, Kang SW, et al. Peroxiredoxins in breast carcinoma. Clin Cancer Res, 2003, 9: 3418-3424.
[11]Kinnula VL, Lehtonen S, Sormunen R, et al. Overexpression of peroxiredoxins I, II, III, V, and VI in malignant mesothelioma. J Pathol, 2002, 196: 316-323.
[12]Lehtonen ST, Svensk AM, Soini Y, et al. Peroxiredoxins, a novel protein family in lung cancer. Int J Cancer, 2004, 111: 514-521.
[13]Crowley-Weber CL, Payne CM, Gleason-Guzman M, et al. Development and molecular characterization of HCT-116 cell lines resistant to the tumor promoter and multiple stress-inducer, deoxycholate. Carcinogenesis, 2002, 23: 2063-2080.
[14]Soini Y, Kallio JP, Hirvikoski P, et al. Oxidative/nitrosative stress and peroxiredoxin 2 are associated with grade and prognosis of human renal carcinoma. APMIS, 2006, 114: 329-337.
[15]Yo YD, Chung YM, Park JK, et al. Synergistic effect of peroxiredoxin II antisense on cisplatin-induced cell death. Exp Mol Med, 2002, 34: 273-277.
[16]Park SH, Chung YM, Lee YS, et al. Antisense of human peroxiredoxin II enhances radiation-induced cell death. Clin Cancer Res, 2000, 6: 4915-4920.
[17]Lehtonen ST, Markkanen PM, Peltoniemi M, et al. Variable overoxidation of peroxiredoxins in human lung cells in severe oxidative stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 288: L997-1001.
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