【摘要】目的用腺病毒载体将乙型肝炎病毒(HBV)基因组导入小鼠体内，研究HBV表达产物诱发的机体免疫反应。方法用AdEasy系统构建含HBV基因组的重组腺病毒AdHBV-WT，感染HepG2细胞后，分别用ELISA和western blot检测细胞培养上清液和细胞裂解物中的HBsAg、HBeAg和HBcAg。AdHBV-WT经在293细胞中扩增、纯化和浓缩后，经滴鼻途径感染BALB／C小鼠，检测体液和细胞免疫反应。结果重组腺病毒AdHBV-WT感染HepG2细胞后，有效地表达出HBV的各种抗原。重组腺病毒感染小鼠可诱导抗-HBc的产生。3H-TdR摄入实验表明，AdHBV-WT可诱发小鼠产生HBcAg特异性的T细胞应答。结论HBV全基因重组腺病毒在体外可表达HBV的各种抗原，并可诱发小鼠产生HBcAg特异性的体液免疫和细胞免疫。 【关键词】乙型肝炎病毒； 重组腺病毒； 免疫反应 Study on the immune response evoked by recombinant adenovirus containing HBV genomeLIU Zhihua，LUO Kangxian，HU Jing，et al．Department of Infectious Diseases，Nanfang Hospital，Guangzhou 510515, China 【Abstract】Objective HBV genome was transferred into mice to study the immune response evoked by HBV expression production． MethodsAdHBV-WT,the recombinant adenovirus containing HBV genome，was constructed using AdEasy system，then infected HepG2 cell lines．The HBV antigens expression in cell culture in vitro was demonstrated by ELISA and Western blot．After amplification，purification and concentration，BALB／C mice were infected by AdHBV-WT intranasally．The immune responses were measured by ELISA for antibody responses and 3H-TdR uptake assay for T cell prolification.ResultsThe recombinant adenovirus AdHBV-WT expressed HBV antigens，HBsAg，HBeAg and HBcAg effectively in HepG2 cell lines. AntiHBc antibody was detected in mice sera in experimental group．Furthermore，T cell proliferation response to HBcAg was also induced by AdHBV-WT，which was confirmed by 3H-TdR uptake assay.Conclusion AdHBV-WT could express HBV antigens effectively in cell culture and induced humoral and cellular immunization in BALB/C mice. 【Key words】Hepatitis B virus； Recombinant adenovirus； Immune response HBV感染所致肝细胞损伤及随后的病毒清除是宿主细胞免疫应答介导的，因此HBV的致病性与宿主的免疫反应密切相关。HBV是一种突变率较高的DNA病毒，变异后的HBV对其致病性和宿主的免疫反应有何种影响，一直是各国学者非常感兴趣的课题，但由于缺乏合适的动物模型，该领域的研究未能深入进行。 复制缺陷型腺病毒载体是一种比较成熟的病毒载体，因其有能够感染多种类型细胞、外源基因转移和表达效率高，以及腺病毒转载的外源基因以附加体的形式表达等特点，目前已被广泛地应用于基因治疗、基因疫苗和基因功能的研究中［1］。本文借助复制缺陷型腺病毒载体将HBV基因组导入小鼠体内，观察HBV表达产物诱导小鼠体液免疫和细胞免疫反应的情况。 材料与方法 一、材料 (一) 质粒 携带1．2拷贝HBV DNA的pBS重组质粒，由上海生化所汪垣教授惠赠；腺病毒骨架质粒pAdEasy-1，穿梭载体pAdTrack由Johns Hopkins大学惠赠。 (二) 菌株、毒种与包装细胞系 E．coli BJ5183及E．coli DHl0B 由Johns Hopkins大学惠赠；E．coli DH5α本室保存；野生5型腺病毒(Ad5)由中国疾病预防控制中心病毒所形态室姜秀丽博士提供；包装细胞系腺病毒E1区转化的人胚肾293细胞引自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，用DMEM培养基(Gibco公司)培养。HepG2细胞为本室保存，用DMEM培养基培养。 （三） 主要试剂 Taq酶、dNTP等PCR相关试剂购自Takara公司；Not Ⅰ、Kpn Ⅰ、Pac Ⅰ和Pme Ⅰ等限制性内切酶购自美国NEB公司；转染293细胞用脂质体(Gibco BRL)试剂；鼠抗-HBc单克隆抗体为中国疾病预防控制中心病毒所肝炎室詹美云教授惠赠；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠第二抗体购自北京中山科技公司；ECL检测系统为Pierce公司产品；3H-TdR由中国原子能研究所提供。 (四)动物6～8周龄雄性的BALB／C小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。 二、方法 (一) 重组腺病毒的构建 采用Johns Hopkins大学He建立的AdEasy系统，具体方法见参考文献［2］。 (二) 重组腺病毒表达HBV抗原的检测 用ELISA法检测HepG2细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg；用Western blot检测细胞裂解物中的HBcAg。感染细胞3 d后，用1×加样缓冲液［50 mmol／L Tris Cl(pH6．8)，1 mmol／L DTT(临用前加入)，2％ SDS,0．1％溴酚蓝，10％甘油］裂解细胞，100°C煮沸10 min，离心后取上清液加样，进行SDSPAGE电泳。电泳结束后，用电转仪将凝胶上的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上，用封闭液(5％脱脂奶粉的TBS)将硝酸纤维素膜封闭2 h，按1∶500将兔抗-HBc多克隆抗体(北京中山生物技术有限公司)稀释于封闭液中，和膜室温孵育2 h，TBST洗涤5次，以1∶2000 HRP标记的羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司)与膜继续室温孵育1 h,TBST洗涤6次，用ECL系统曝光(Pierce公司)显迹。 (三) 重组腺病毒的扩增、纯化和滴度测定 (1) 扩增和纯化：大量培养293细胞，待细胞生长至80％～90％时，接种重组腺病毒。3～4 d后，收获重组腺病毒，待收获的病毒悬液总量为100 ml时，转入离心管中，以7 000 g离心15 min，沉淀的细胞用生理盐水重悬，-70°C冷冻，37°C水浴融化，旋涡震荡，反复4次，7 000 g离心15 min，取上清液，加PEG8000沉淀病毒，采用CsCl密度梯度离心法纯化，于-70℃保存。(2) 滴度测定：6孔板接种293细胞，待细胞丰度为80％～90％时，每孔中仍保留约1 ml培养液，将多余的弃去。取待滴定的病毒悬液，用维持液(2％ FCS的DMEM)进行系列稀释，取6个不同的稀释度感染细胞，每稀释度做复孔，于37°C、5％ CO2孵箱培养，吸附病毒约3 h，补加培养液至3 ml，接种重组腺病毒36 h后将细胞培养板置于荧光显微镜下，计数各稀释度病毒产生的绿色荧光斑点数目和病毒滴度。下面的公式可用来计算病毒的滴度： efu／ml=绿色荧光斑点均数／稀释倍数×体积(ml) (四) 动物实验 (1) 实验分组和免疫方法：6～8周龄雄性的BALB／C小鼠，随机分为3组，每组6只小鼠。实验组经鼻腔途径接种重组腺病毒AdHBV-WT，以接种野生5型腺病毒和生理盐水的小鼠为对照组，接种剂量为5×107 efu。4周后，经尾部采血，并用与初次免疫时等量的病毒加强免疫1次。7 d后，经小鼠眼球采血，颈椎脱臼处死小鼠。(2) HBV特异性抗体的检测：竞争ELISA法测定小鼠血清标本中HBV的特异性抗体，用ELISA试剂(华美公司)检测抗HBs、抗HBe和抗-HBc，操作按说明书进行。用酶标仪(Bio Rad Lab，California)读取A450值。小鼠血清抗体滴度用竞争率表示。用间接ELISA法测定小鼠血清中抗-HBc的IgG亚类。(3) 淋巴细胞增殖实验：具体方法参见文献［3］。 结果 一、重组腺病毒的形态学观察 293细胞经反复冻融后释放出重组腺病毒，经磷酸钨负染，在透射电镜下呈典型二十面体结构，直径约为70 nm，具有典型的腺病毒形态，未见有其他微生物污染(见图1）。 图1略 二、HBV抗原在HepG2细胞中的表达 (一) HBsAg和HBeAg 感染前1 d将1瓶HepG2细胞1传3，进行细胞计数，每瓶细胞数量调为2．5×106。3种重组腺病毒均以MOI=25 efu／cell感染HepG2细胞，每24 h换液并收集细胞上清液，-20℃保存待检，连续收集7 d。ELISA检测结果表明，在感染后1 d即可检出HBeAg。HBeAg的A值，在感染后第2～4天达到峰值；HBsAg在感染后第4天达到峰值。 (二) HBcAg 细胞裂解物经SDSPAGE电泳和western blot检测，在21KD处均出现与抗-HBc多克隆抗体发生特异性结合的阳性条带，说明重组腺病毒AdHBV-WT可表达HBcAg。 三、重组腺病毒的滴度 重组腺病毒经扩增、纯化后，用荧光斑点计数法测定病毒滴度。结果病毒滴度为5×108 efu／ml。 四、重组腺病毒感染小鼠后的免疫反应 (一) 体液免疫 1.抗HBs和抗HBe经初次和再次接种，3组小鼠血清中抗HBs和抗HBe均为阴性；2.抗-HBc初次接种4周后，AdHBV-WT组小鼠有应答，但抗体阳性率及抗体水平较低。再次接种7 d后，实验组小鼠抗体阳转率为100％，且抗体水平也有所升高，对照组小鼠无阳转。 (二) 小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应 小鼠脾脏淋巴细胞用重组HBcAg体外刺激后，3H-TdR摄入法在实验组小鼠的淋巴细胞检出明显的增殖反应，4．9<SI<15．5，平均为7．8，而对照组没有出现，SI值均低于2．5。 讨论 为了在体内实验研究HBV的生物学特性，人们尝试用各种方法将克隆化的HBV DNA运送至动物体内，但迄今没有一种理想的方法能够达到这一目的。裸DNA和脂质体只能进入有限数量的肝细胞［4］；重组杆状病毒虽然能够在体外细胞培养系统中将HBV基因组导入细胞内，但应用于体内时即被补体系统灭活。重组腺病毒已广泛用于基因治疗等研究中，能够感染多种不同宿主细胞，包括静息期细胞，并且相对容易制备，又比较安全，因此是一种理想的病毒载体。我们用腺病毒载体将HBV基因组转入小鼠体内，试图在小鼠体内研究HBV基因组的生物学特性和表达产物的免疫原性，为深入研究HBV基因变异打下基础。 本文采用1998年He等［2］报道的一种制备重组腺病毒简便方法。该系统与传统方法相比，最大的优势在于同源重组在大肠杆菌内发生而不是在真核细胞中，从而大大提高了重组效率，也避免了空斑纯化的繁琐。我们采用AdEasy系统，将1．2拷贝的HBV基因克隆入腺病毒基因组，经过293细胞的包装，成功地获得了重组腺病毒AdHBV-WT。 AdHBV-WT感染HepG2细胞后，细胞培养上清液和细胞裂解物中可检出HBsAg、HBeAg和HBcAg，说明1．2拷贝的HBV基因组在腺病毒载体的介导下转入肝源细胞内，在自身调控元件的作用下，能够有效地表达HBV的各种抗原。AdHBV-WT感染BALB／C小鼠后，实验组小鼠血清中抗-HBc全部阳转，抗-HBc的平均竞争率为76．4％；小鼠脾脏淋巴细胞用重组HBcAg体外刺激后，3H-TdR摄入法在实验组小鼠的淋巴细胞均检出明显的增殖反应，平均SI值为7．8，而对照组没有出现，SI值均低于2．5，说明AdHBV-WT感染BALB／C小鼠后，可有效诱导产生HBcAg特异性的体液免疫和细胞免疫反应，但AdHBV-WT未能诱发小鼠产生针对HBsAg和HBeAg的免疫反应。这可能是以下原因造成的：(1) 可能与HBV表达的组织特异性有关。S基因的表达受两个串联的启动子的调控，spl(nt22192780)和sp2(nt28093152)。其中，spl有肝细胞核因子HNF的结合序列，只有肝特异因子与之结合，才能显著提高转录水平［5］。本研究中外源基因HBV DNA不受外源启动子的控制，而是使用自身启动子，因此AdHBV-WT感染小鼠后，HBsAg未能有效地在小鼠体内表达。(2) 与AdHBV-WT的感染剂量有关。本研究中使用的重组腺病毒的感染剂量为5×107 efu，比周智等［6］使用的感染剂量9×108 pfu低。低感染剂量的重组腺病毒在小鼠体内表达的抗原量较少，因此未能诱发小鼠的免疫反应。 通过以腺病毒为载体的基因转移，将1．2拷贝的HBV基因组转入HepG2细胞和小鼠体内，成功地表达了HBV的各种抗原，并诱发BALB／C小鼠产生HBcAg特异性的体液免疫和细胞免疫反应，为进一步研究HBV变异株的分子生物学和免疫学特性奠定了基础。 参考文献 1Walther W, Stein U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases. Drugs, 2000,60∶249-271. 2He, TC, Zhou S, da Costa LT, et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95∶2509-2514. 3巴德年主编．当代免疫学技术与应用.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社．2001，203-208. 4Takahashi H, Fujimoto J, Hanada S, et al. Acute hepatitis in rats expressing human hepatitis B virus transgenes. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92∶1470-1474. 5Raney AK, McLachlan A. Characterization of the hepatitis B virus major surface antigen promoter hepatocyte nuclear factor 3 binding site. J Gen Virol, 1997, 78∶3029-3038. 6周智，张定凤，任红．HBsAg和B7-2抗原重组腺病毒载体感染免疫研究．中华肝脏病杂志，2001，9∶111-113. 上海《肝脏》杂志社版权 |