【摘要】目的研究腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）Rep78蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用及机制。方法将土拨鼠肝炎病毒（WHV）全基因组DNA从质粒中酶切回收，线状DNA重新连接呈环状。用脂质体Fugene 6体外转染至HepG2细胞，同时共同转染含有Rep78的质粒AAVdl5291。5 d后收获细胞DNA，Southern blot检测WHV DNA复制。以含有HBV全长的质粒为模板，PCR法分别扩增出HBV-S、C和X基因全长。以凝胶电泳阻滞实验（EMSA）检测Rep78与HBV-S、C和X的结合。结果Southern blot结果表明，AAV-Rep78可以明显抑制WHV病毒在HepG2细胞中的复制，并呈剂量依赖关系。EMSA结果显示，Rep78蛋白在体外能够与HBV-S、C和X的DNA结合，其中与HBV-C的结合最强而且有剂量依赖关系。此外，这种Rep78蛋白与HBV-C DNA结合可以被特异性的Rep78抗体阻滞，形成超结合带。结论AAV-Rep78可以抑制HBV DNA的复制，其机制可能在于Rep78蛋白结合并抑制了HBV-C基因。 【关键词】腺相关病毒； Rep78； 乙型肝炎病毒 Inhibition of hepatitis B virus replication by adeno-associated virus Rep78 protein in vitroLIU Tianhui, CONG Min, WANG Ping, et al.Liver Disease Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing, 100050， China. 【Abstract】ObjectiveAdeno-associated virus (AAV) Rep78 is known for inhibition of several viruses, such as adenovirus and human papillomavirus, replication and oncogenes transformation. This study is to investigate the effect of AAV Rep78 on hepatitis virus replication and the mechanisms. MethodsWoodchuck hepatitis virus (WHV) was removed from the plasmid and recircularized. HepG2 cells were transfected with the recircularized WHV DNA and Rep78 plasmids. After 5 days, total cellular DNA was digested with DpnI, size separated, Southern blotted and probed with 32PWHV DNA. HBV-S, C or X gene were amplified by PCR. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was utilized to detect the binding of MBPRep78 protein with HBV-S, C or X genes.ResultsWHV replication was reduced by the presence of AAV Rep78 expression plasmid in a dosedependent manner. EMSA showed all the three genes, HBV-S, C or X gene, could bind to Rep78 protein, with HBV-C DNA the strongest. Moreover, the binding of HBV-C DNA to Rep78 protein was not only in a dosedependent manner, but also could be retarded by specific Rep78 antibody.ConclusionAAV Rep78 could inhibit the replication of hepatitis virus, this effect may be through its binding with HBV-C gene. 【Key words】Adeno-associated virus; Rep78; Hepatitis B virus 腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一种单链DNA病毒。由于它无致病性，可以整合至染色体持续表达，并且可以高效率感染人的大多数细胞等特点，因而作为一种病毒载体已成为基因治疗的有利工具［1］。 首先发现AAV可以抑制的病毒是人乳头瘤状病毒（human papillomavirus, HPV），HPV是宫颈癌的主要致病因素，而在AAV抗体增高的HPV感染病人中宫颈癌的发病率显著降低。除了HPV外，AAV还可以抑制腺病毒、人类免疫缺陷病毒、牛乳头瘤状病毒、单纯疱疹病毒和类猿病毒SV40等。1989年AAV抑制病毒的作用首次被定位于Rep78蛋白。 AAV基因具有两个开放读码框Rep和Cap，Rep包含P5启动子和P19启动子。P5启动子有两种RNA转录产物,编码生成Rep78蛋白和Rep68蛋白,其中Rep78最为重要［2］。它除具有自身DNA复制、整合和对病毒本身基因调节的作用外，还有另外一项重要作用，就是抑制其他某些病毒及癌基因的转化。AAV Rep78是否具有抑制HBV的作用，本文主要通过体外转染HepG2细胞及凝胶阻滞实验等方法进行了探讨。 材料与方法 一、材料 Fugene 6转染试剂购自美国Roche公司，DpnI内切酶购自美国New England Biolabs公司，T4 DNA连接酶, T4多核苷酸激酶和随机引物标记探针试剂盒购自美国Promega公司，PCR扩增和纯化试剂盒购自德国Qiagen公司，Rep78抗体购自美国APR公司。含有土拨鼠肝炎病毒(WHV)全基因组的质粒、HBV全基因组的质粒和AAVRep78的质粒由美国阿肯色州立医科大学基因治疗中心Hermonat和Liu教授惠赠。麦芽糖结合蛋白(MBP)Rep78的构建、MBP、MBPRep78蛋白获得和纯化，详见文献［3］。 二、方法 （一） 获得环状WHV 用EcoR I酶切含WHV全基因组DNA的质粒，琼脂糖凝胶电泳去除载体部分，回收WHV线状DNA，用T4 DNA连接酶重新连接呈环状。 （二） 转染HepG2细胞 将2 μg重连的WHV全长DNA与不同剂量的含Rep78的质粒AAVdl5291用脂质体Fugene 6包裹，体外共同转染HepG2细胞。HepG2细胞于10%胎牛血清的DMEM培养基中在37℃，5%CO2条件下进行培养。5 d后用含有蛋白酶K的细胞裂解液，酚/氯仿/异丙醇的方法提取细胞DNA，紫外分光光度计定量并用琼脂糖凝胶电泳再次确认。 实验共分为6组：①空白对照组：只转染2 μg WHV DNA，不转染AAVdl5291；②Rep78转染1 μg组：2 μg WHV DNA与1 μg AAVdl5291共转染；③Rep78转染3 μg组：2 μg WHV DNA与3 μg AAVdl5291共转染；④Rep78转染9 μg组：2 μg WHV DNA与9 μg AAVdl5291共转染；⑤阴性对照组：只转染3 μg AAVdl5291，不转染WHV DNA；⑥正常HepG2对照组。为排除各组质粒含量不同本身对复制可能造成的影响，在各组转染体系中均加入相应含量的AAVdl695质粒（与AAVdl5291相比缺少rep78的一段基因），最终使各转染体系的质粒含量相同。 (三) Southern blot检测WHV DNA复制 取不同实验组细胞总DNA 10 μg，DpnI酶切去除外源性DNA，再进行琼脂糖凝胶电泳。将电泳后的凝胶用0.3 mol/L盐酸作用10 min，经过变性和中和，毛细管法过夜将DNA从凝胶转印至尼龙膜，紫外光照射固定DNA。用随机引物法将32P标记WHV片段，65℃杂交过夜，洗膜后放射自显影。 (四) HBV-S, C及X基因的获得及纯化以含有HBV基因全长的质粒为模板，HBV-S基因上游引物5′-TGCACCGAACATGGAGAGC-3′，下游引物5′-AGTAGCCCCAACGTTTGGT-3′，扩增片段为720 bp；HBV-C基因上游引物5′-ACTGTTCAAGCCTCCAAGC-3′，下游引物5′-GAGTCCAAGGGATACTAAC-3′，扩增片段为607 bp；HBVX基因上游引物5′-ACTCGGTTGTCCTCTCTCG-3′，下游引物5′-GAGATGATTAGGCAGAGGTG-3′，扩增片段为508 bp。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 50 s，58 ℃ 55 s，72 ℃ 60 s，共32个循环，72 ℃ 10 min 终止反应。 取 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）电泳。切取相应大小的片段，应用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化这3种PCR产物。对纯化后的DNA测序并定量。 (五) 凝胶电泳阻滞实验（EMSA）用32P-ATP末端标记法分别标记纯化后的PCR产物HBV-S、C和X，将3种DNA分别与多核苷酸激酶(PNK)缓冲液混合，65 ℃ 作用10 min。放置至室温，加入T4 PNK酶和32P-ATP，37℃孵育1 h。以寡核苷酸纯化试剂盒对已经标记同位素的DNA进行纯化。 本文共有两个凝胶电泳阻滞实验。第一个是Rep78蛋白分别与HBV-S、C和X基因DNA的结合实验。第二个是Rep78蛋白与HBV-C结合剂量依赖实验和抗体阻滞实验。本实验中采用的是融合蛋白MBPRep78。为了保证Rep78蛋白的产量和纯度，在两个实验中均采用单纯的MBP作为对照组。配制4% PAGE凝胶，分别准备样品，与5×结合液 5 μl，0.5 mol/L DTT 0.05 μl，poly(dIdC) 0.5 μl，25 mmol/L MgCl2 6 μl，50%甘油4 μl混合，加水至25 μl，室温放置作用20 min，上样后120 V电泳5 h，真空干胶后放射自显影。 结果 一、AAV-Rep78抑制WHV在HepG2细胞中的复制 收获的细胞DNA经过DpnI酶的处理，带有甲基的外源性DNA被酶切去除，仅保留着在HepG2细胞中内源性新生的（De Novo）复制的WHV，因此通过Southern blot的比较，可以反映WHV复制的情况。图1显示与仅加入载体，不含有Rep78的对照组相比，共转染AAV-Rep78的HepG2细胞WHV复制显著降低，提示Rep78抑制了WHV在HepG2细胞中的复制，并且随着Rep78的剂量增加，这种抑制作用越加明显，呈剂量依赖关系。 二、Rep78蛋白可以分别与HBV-S、C和X基因DNA结合，其中与HBV-C结合最强 EMSA显示， 32P-ATP标记的 HBV-S、C和X基因 图1（略） DNA作为游离探针出现在泳道底部。MBP蛋白作为实验的阴性对照，电泳后没有DNA蛋白复合物的高分子量阻滞带出现，说明MBP蛋白本身未与HBV基因结合（泳道2、5、8），而MBPRep78蛋白与以上3种基因DNA结合形成高分子量复合物（泳道3、6、9），泳动速度明显减慢，在胶的上部出现阻滞带，其中Rep78与HBV-C结合最为明显(见图2)。另外，在MBPRep78蛋白与3种基因结合的阻滞带中可见多条带，提示Rep78分别与HBV-S, C和X基因有多个结合位点。 图2（略） 三、Rep78蛋白与HBV-C基因的结合具有剂量依赖性和特异性 EMSA显示，随着MBPRep78蛋白剂量从0.1 μg、0.3 μg至1.0 μg的增加，Rep78与HBV-C基因的结合也随之增强，呈现剂量依赖关系（见图3）。可以看到Rep78抗体、MBP-Rep78蛋白与HBV-C基因形成了抗体-蛋白-DNA的超级复合物，比单纯的蛋白-DNA复合物具有更高的分子量，因而出现了超级阻滞带（泳道6）。与泳道5相比，泳动速度更慢，提示MBP-Rep78蛋白与HBV-C基因确实发生了结合。 讨论 Rep78抑制其他病毒的作用机制主要有两方面：一是抑制病毒复制。如它可以结合并抑制HIV-1末端重复序列，从而减少HIV复制，还可以通过抑制腺病毒E2a，减少腺病毒复制和细胞毒性［4］；二是抑制转录。已经报道的可以被Rep78抑制的细胞或病毒转录因子有Sp1, TBP, PC4, E2F和c-Jun等［5］。 图3（略） 本研究在体外实验HepG2细胞中应用了土拨鼠病毒复制的细胞模型。研究提示，Rep78可以抑制WHV复制，并进一步在体外DNA与蛋白结合实验中发现主管HBV病毒复制的C基因可以与Rep78蛋白明显结合。发现Rep78抑制肝炎病毒的意义不仅在于可能为抗HBV提供了新的思路，还在于可以利用并改进AAV重组病毒载体用于基因治疗。现在的重组病毒载体大多是删除了Rep和Cap基因，仅保留了AAV两端的末端重复序列，以求更小的免疫原性和更大的包装能力。本研究提示，可能在将来的肝炎基因治疗中，利用并保留Rep78基因与肝炎病毒结合和抑制的特点，改进重组病毒载体，达到更好的基因治疗效果。 参考文献 1Wang Z, Ma HI, Li J, et al.. Rapid and highly efficient transduction by doublestranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther, 2003, 10∶2105-2111. 2Stracker TH, Cassell GD, Ward P, et al. The Rep protein of adeno-associated virus type 2 interacts with singlestranded DNAbinding proteins that enhance viral replication. J Virol, 2004, 78∶441-453. 3Batchu RB, Miles DA, Rechtin TM, et al. Cloning, expression and purification of full length Rep78 of adeno-associated virus as a fusion protein with maltose binding protein in Escherichia coli.Biochem Biophys Res Commun, 1995, 208∶714-720. 4Nada S, Trempe JP. Characterization of adeno-associated virus rep protein inhibition of adenovirus E2a gene expression. Virology, 2002, 293∶345-355. 5Prasad CK, Meyers C, Zhan DJ, et al. The adeno-associated virus major regulatory protein Rep78cJunDNA motif complex modulates AP1 activity. Virology, 2003, 314∶423-431. 上海《肝脏》杂志社版权 |