【摘要】目的探讨内毒素血症时库普弗细胞激活对肝细胞损伤的作用机制。方法用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流，Percoll密度梯度离心分离、纯化SD大鼠肝细胞和库普弗细胞，制备内毒素（LPS）刺激的库普弗细胞的条件培养基（KCCM）并作用于肝细胞，检测肝细胞培养基丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）的含量，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测KCCM对大鼠原代肝细胞活性的影响。结果KCCM作用于肝细胞2 h后，肝细胞培养基中ALT、AST及LDH含量均明显升高（P＜0.05），在2～4 h内随时间延长ALT、AST及LDH含量均逐渐增加，呈明显的时间效应关系；MTT结果显示，KCCM作用后12 h、24 h时间点对肝细胞具有明显损伤作用（P＜0.05）。结论内毒素诱导库普弗细胞释放的可溶性因子作用一定时间后可直接对肝细胞造成损伤。
【关键词】内毒素； 库普弗细胞； 肝细胞 The cytotoxic effects of Kupffer cellconditioned medium on primary cultured rat hepatocytesYAO Jinghong, HE Yongwen, JIE Shenghua.Department of Infectious Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China
【Abstract】ObjectiveTo study the roles of Kupffer cells activated by lipopolysaccharides (LPS) on rat primary cultured hepatocytes in endotoxemia. MethodsHepatocytes and Kupffer cells were isolated from liver of SpragueDawley rats by in situ perfusion with pronase and collagenase and density gradient centrifugation with Percoll, and then were cultured. The Kupffer cells were stimulated by LPS and kuffer cellcondifioned medium (KCCM) was collected. After hepatocytes exposed to KCCM in different time, transaminase (ALT and AST) and lactate dehydrogenate (LDH) were measured in the supernatants. Meanwhile, MTT colori metric assay was used to detect the effects of KCCM on hepatocytes. ResultsThe concentrations of ALT, AST and LDH were increased gradually. There was significant timedependent relationship between KCCM and release of transaminase and LDH in the supernatants of rat primary cultured hepatocytes from 2 h to 24 h. The results of MTT revealed that hepatocytes were signiflcantly injuried at 12 h and 24 h（P＜0.05）. ConclusionThe soluble factors released by Kupffer cells, which were activated by LPS, could cause direct hepatocytes injury.
【Key words】Endotoxin; Kupffer cells; Hepatocytes
内毒素血症时，库普弗细胞能释放趋化因子，募集外周血炎性细胞进入肝脏，加重肝细胞损伤［1,2］。有研究报道脂多糖刺激库普弗细胞后释放的可溶性因子能促进肝星状细胞增殖和胶原沉积，与肝纤维化密切相关［3］。我们收集了库普弗细胞的条件培养基(Kupffer cell conditioned medium，KCCM)，作用于培养的肝细胞，观察其对肝细胞的代谢和增殖变化以及损伤情况，以探讨内毒素对肝细胞的损伤机制。
材料与方法
一、肝细胞与库普弗细胞的分离、培养与鉴定参考Knook DL和Braet F的方法［4,5］。分离、纯化、收集肝细胞和为库普弗细胞。将两种细胞分别以5×105/ml接种于6孔培养板上，在含10 ％胎牛血清、100 U/ml penicillin G和100 mg/ml streptomycin的DMEM中培养。培养的肝细胞每3 d半量换液，培养第6天的细胞用于实验。
ED1是库普弗细胞特异性分子标记蛋白，本文用ED1免疫荧光细胞化学染色法鉴定分离的细胞是否为库普弗细胞。
二、KCCM的制备
库普弗细胞培养3 d后，细胞全量更换无血清培养基，并加入终浓度为1 μg/ml LPS（E. coli 055: B5, Sigma Co., USA），刺激细胞30 min后，以DHanks液洗细胞3次，再加入新鲜无血清培养基培养12 h后，收集KCCM，－70℃冻存待用。
三、大鼠原代肝细胞培养基ALT、AST、LDH活性的测定
实验时，将肝细胞培养基全部吸去，每孔加入KCCM 0.5 ml，在2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时间点再收集此培养基立即用于检测。按ALT、AST、LDH检测试剂盒（南京建成生物制品研究所）提供的方法进行，单位用U／L表示。
四、KCCM对大鼠原代肝细胞活性的影响
用MTT法观察KCCM对大鼠原代肝细胞活性的影响。将对数生长期的肝细胞以1×104个／孔接种于96孔板，CO2孵箱内培养24 h后，在不同时间每孔加入KCCM200 μl，另设空白对照孔。每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl，37℃继续孵育4 h，终止培养。吸弃上清液后每孔加入DMSO 150 μl，振摇10 min，酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光度(A值)，参考波长为630 nm，各组均重复6次。增殖抑制率＝1－实验组A值/对照组A值×100％。
五、统计学处理
结果以均数±标准差表示，采用SPSS 10.0软件，进行方差分析。
结果
一、原代培养大鼠库普弗细胞、肝细胞的形态
相差显微镜下观察，新分离的库普弗细胞呈圆球形，折光性强，悬浮于培养基中；1h后可见大部分细胞已贴壁，多呈扁圆形；24 h见大量细胞伸展，高倍镜下胞质内可见吞噬颗粒；3 d时见细胞呈典型的星形或多角形，胞浆透明。荧光显微镜下观察，在328 nm波长紫外光照下，未观察到细胞自发荧光。培养3 d 后，ED1免疫荧光细胞化学染色阳性细胞> 95%（图1略）。新分离的肝细胞呈圆形，透亮，立体感强，体积明显大于库普弗细胞；培养4 h后，大部分细胞贴壁生长，24 h后肝细胞转变成多角形，培养3～4 d，细胞汇合90％（图2略）。图1a相差显微镜下培养24 h的大鼠库普弗细胞 ×200图1b培养3 d的大鼠库普弗细胞ED1免疫荧光检测 ×200图2a相差显微镜下培养24 h的大鼠肝细胞 ×200
二、KCCM对肝细胞产生ALT、AST及LDH的影响
KCCM作用于肝细胞2 h后，肝细胞培养基中ALT、AST及LDH含量均高于对照组（P＜0.05）。在2～24 h内，随时间延长ALT、AST及LDH含量逐渐增加，KCCM对肝细胞的损伤作用呈明显的时间效应关系，说明KCCM能诱导肝细胞损伤。（表1略）
三、KCCM对大鼠原代肝细胞活性的影响
KCCM作用于肝细胞后，在2 h、4 h和8 h时间点，吸光度值虽低于对照组，肝细胞的活性受到不同程度抑制，但与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。在12 h、24 h时间点，吸光度值均低于对照组（P＜0.05），肝细胞活性受到抑制，说明KCCM对大鼠肝细胞具有明显损伤作用。（表2略）
讨论
本研究应用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌注法分离大鼠肝脏细胞，经Percoll密度梯度离心分离及差速贴壁方法分别得到肝细胞和库普弗细胞，经形态学观察和免疫组化鉴定，细胞纯度高，可用于研究其生物学功能。我们进一步检测了KCCM作用不同时间后，原代肝细胞培养基中ALT、AST和LDH的含量变化，以评估肝细胞的损伤情况。在KCCM的作用下，肝细胞培养基中的ALT、AST和LDH释放明显增加，说明KCCM能诱导肝细胞的损伤。
MTT可较好地反映细胞活性或增生的状态，吸光度A值越高，细胞存活越多或增生越强。我们通过用MTT法对KCCM作用的体外培养正常大鼠肝细胞进行测定，结果显示：随着KCCM作用时程延长，其对肝细胞的损伤作用增强，在12 h、24 h最为明显，说明KCCM中的可溶性因子能造成肝细胞损伤甚至致其死亡。
正常的库普弗细胞培养基上清能促进肝细胞DNA合成［6］。有研究证实，LPS刺激后，激活库普弗细胞TLR4，诱导细胞合成、释放大量的炎性介质，如细胞因子（TNFα，IL-1等）、趋化因子、NO等［7,8］。目前认为，在内毒素血症时，炎性介质(TNFα、NO等）浓度升高引起的肝细胞损伤，是库普弗细胞激活的结果，而不是由LPS刺激肝细胞直接引起［9］。由于NO的半衰期极短，KCCM对肝细胞的损伤和活性抑制作用应不是主要由NO引起，而是TNFα及其他可溶性因子作用的结果。在某些条件下，LPS激活库普弗细胞所释放的可溶性因子还具有其他作用。如LPS诱导库普弗细胞释放IFNα和IFNγ，能抑制肝细胞内嗜肝DNA病毒（Hepadnavirus）转录后的早期翻译过程［10］。
病理情况下，库普弗细胞能通过表达FasL，与肝细胞表面的Fas直接结合，诱导肝细胞凋亡［11］。库普弗细胞还募集中性粒细胞和淋巴细胞进入肝组织，加重肝细胞损伤。本实验中强调的是库普弗细胞通过合成、释放的可溶性因子，以非接触方式直接产生肝细胞毒性，库普弗细胞和肝细胞的相互作用及其结果值得深入、全面地研究。
参考文献
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3Zhang X, Yu WP, Gao L, et al. Effects of lipopolysaccharides stimulated Kupffer cells on activation of rat hepatic stellate cells. World J Gastroenterol, 2004, 10(4)∶ 610-613.
4Knook DL, Blansjaar N, Sleyster EC.Isolation and characterization of kupffer and endothelial cells from the rat liver. Exp Cell Res, 1977, 109∶ 317-329.
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9Mustafa SB, Olson MS. Effects of calcium channel antagonists on LPSinduced hepatic iNOS expression. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 1999, 277∶ 351-360.
10Klocker U, Schultz U, Schaller H, et al. Endotoxin stimulates liver macrophages to release mediators that inhibit an early step in hepadnavirus replication. J Virol, 2000, 74(12)∶ 5525-5533.
11Yang J, M.D., Gallagher SF., et al. Kupffer cellderived Fas ligand plays a role in liver injury and hepatocyte death. J gastrointest surg, 2004, 8∶ 166-174. 上海《肝脏》杂志社版权
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