【摘要】目的评价以乙型肝炎病毒核心区为载体的HBsAg “a”决定簇编码基因的基因免疫效果。方法分别使用将编码截短型乙肝病毒核心抗原的主要免疫显性区替换为表面抗原“a”决定簇嵌合基因的真核表达质粒；编码表面抗原“a”决定簇部分的质粒和空载体为免疫原，免疫4～6周龄的BALB/c小鼠，定期采血检测体液免疫应答情况并取免疫后小鼠脾细胞进行淋巴细胞增殖试验。结果嵌合质粒免疫组针对HBsAg的体液应答水平低于非嵌合质粒免疫组，且未引起较强的HBcAb体液免疫应答，但获得了较强的HBcAg和HBsAg特异性的细胞应答。结论该嵌合质粒作为基因疫苗可以引起较强的HBcAg和HBsAg特异性的细胞应答并诱导小鼠产生HBsAb。HBcAg在一定程度上可以增强对插入抗原的免疫应答，是一种有效的病毒样颗粒载体；该嵌合基因有望成为一种新的慢性HBV感染的治疗性基因疫苗。
【关键词】乙型肝炎病毒; 基因免疫; 刺激指数; 病毒样颗粒 The Evaluation of the immunologic effect of the chimeric plasmid encoding HBsAg “a” determinant region with truncated HBV core gene as vectorLI Lei, ZHANG Zhenhua, TIAN Yongjun, et al.Division of Clinical Immunology, Tongji Hospital of Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030, China
【Abstract】ObjectiveTo evaluate the immunologic effect of the chimeric plasmid encoding HBsAg “a” determinant region with truncated HBV core gene as vector. MethodsUsing the chimeric plasmid encoding truncated HBV core protein and HBsAg “a” determinant, nonchimeric plasmid and pcDNA3 vector as immunogen to inoculate BAL B/c mice of 4～6 weeks old separately. After with a injection of cardiotoxin in legs of mice 7 days before, 100 μg plasmid was inoculated to each mouse. HBsAb and HBcAb were measured with indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) at different time points and performed lymphocyte proliferation test with spleen cells. ResultsThe protective humoral response to HBsAg of chimeric plasmid immunized group was weaker than nonchimeric group; the antiHBc response was very weak. But the specific lymphocyte proliferation activity was considerable strong when use HBsAg or HBcAg as stimulator in chimeric plasmid immunized mice. ConclusionAs a kind of genetic vaccine, this chimeric plasmid induces effective HBsAb response but no significaut HBcAb response, on the other hand it clicits stronger HBcAg and HBsAg specific T lymphocyte response in inoculated mice. HBcAg is an kind of effective viruslike particle vector as it can enhance the immune response to the expressed antigen. The chimeric plasmid could hopeful be a therapeutic vaccine candidate for chronic HBV infection.
【Key words】hepatitis B virus; genetic immunization; stimulating index; viruslike particles
随着对慢性乙型病毒性肝炎免疫发病机制的深入认识，人们越来越意识到免疫治疗策略在治疗中的重要性［1］。目前虽然国内外对治疗性基因疫苗进行了研究，但尚缺乏明确有效的试验结果。
大量的研究表明HBc颗粒作为类病毒载体可以将单拷贝抗原转变为多拷贝抗原、将可溶性抗原转变为颗粒性抗原、使单纯的TI和TD抗原转变为具有TI及TD双重特性的抗原，因而在蛋白水平可以增强对插入外源表位的体液和细胞免疫应答。我们选用乙肝病毒表面抗原“a”决定簇作为插入表位，分别对乙肝病毒核心区与“a”决定簇嵌合基因编码质粒、非嵌合质粒的免疫效果进行评价。
材料与方法
一、质粒、主要试剂及实验动物
嵌合质粒(pcDNA3/HBc178aaHBs100162aaHBc83144aa)和非嵌合质粒(pcDNA3/HBs100162aa) 由本研究室构建［2］；pcDNA3空载体购自Invitrogen公司。HRP标记兔抗小鼠Ig抗体购自丹麦DAKO公司；MTT购自美国Sigma 公司；心肌毒素购自德国Hereuschuer公司。
二、质粒的制备
使用SDS碱裂解法－聚乙二醇沉淀法大量制备并纯化质粒［7］。
三、动物分组及免疫流程
每组5只动物，分别在小鼠股四头肌注射心肌毒素（0.67 μg/μl）100 μl后1周进行。免疫方案如表1所示。 表1（略）
在每次免疫前以及末次免疫后2、4、6、8周进行眶内采血200 μl。血标本于37℃静置30 min后，4℃静置过夜，恢复至室温后离心取血清，-20℃冻存备用。并于末次免疫后第8周处死小鼠，取脾进行淋巴细胞增殖试验。
四、体液免疫应答的检测
间接ELISA法检测小鼠血清中HBsAb及HBcAb：加入PBS 1∶10稀释的待检血清100 μl/孔；37℃ 1小时；洗涤5次，拍干；加入HRP羊抗鼠Ig（1∶2000稀释）；37℃ 40分钟；洗涤5次，拍干；加入显色液，37℃ 10～15min，终止反应；酶标仪450 nm测A值（参考波长630 nm）并记录。
五、细胞免疫应答的检测
淋巴细胞增殖试验：小鼠处死取脾，200目滤网分离淋巴细胞。调整细胞浓度至4～5×105/ ml。向96孔培养板内加入细胞悬液100 μl/孔；分别加入适量刺激原，补充RPMI1640完全培养基至200 μl/孔，刺激原终浓度分别为HBsAg 15 μg/ml、HBcAg 10 μg/ml，并设立空白对照孔。 培养4天，收集培养上清于-20℃冻存备用。每孔加入RPMI1640完全培养基75 μl和5 mg/ml MTT 25 μl。CO2培养箱孵育4小时。加入DMSO 100 μl/孔，充分溶解混匀，492 nm处测定A值，计算刺激指数（SI）（刺激指数（SI）=刺激孔A492值/空白孔A492值）。
六、统计学处理
使用SPSS11.5统计软件进行分析处理。各时间点的HBsAb和HBcAb水平比较采用配对均数的T检验，不同抗原刺激组的刺激指数采用成组设计的方差分析进行多组样本均数的两两比较。
结果
一、免疫用质粒酶切目的基因鉴定电泳结果
分别将免疫用三种质粒用目的基因片段两侧限制性内切酶位点，进行目的基因片段的酶切鉴定。可见非嵌合/嵌合质粒经EcoRⅠ+XhoⅠ/ HindⅢ+XbaⅠ双酶切后分别得到约210bp/672bp特异性条带，与预期片段大小相符（图1略）。各目的基因序列经测序证实均与模板一致。
二、各组小鼠免疫后不同时间血清抗－HBs水平比较
将A、B、C组间免疫后HBsAb水平按不同时间点进行配对t检验发现AB（P＝0.001）、BC（P＝0.001）、AC（P＝0.002）组间均具有显著性差异（P值均小于0.01）（图2略）。提示嵌合质粒及非嵌合质粒免疫小鼠后均可诱导产生明显的抗HBs应答，并随着免疫次数的增加抗体水平逐渐升高，但嵌合质粒免疫组的HBsAb水平低于非嵌合质粒免疫组。
三、各组小鼠免疫后不同时间血清抗－HBc水平比较
将A、B、C组间免疫后HBcAb水平按不同时间点进行配对t检验发现：AB组（P＝0.061）、BC组（P＝0.050）和AC（P＝0.193）组间均无显著性差异（P≥0.05）（图3略）。提示三种质粒免疫后均未诱导小鼠产生明显的抗HBc应答。
四、各组小鼠免疫后淋巴细胞增殖试验结果
比较不同免疫组HBsAg和HBcAg作为刺激原进行淋巴细胞增殖实验的刺激指数发现：用HBsAg刺激时A、B、C三组均有显著性差异，其中AB组（P ＜0.05）、BC组（P ＜0.01）和AC（P ＜0.01）。用HBsAg刺激时A和B/C组间有显著性差异（P ＜0.01）(表2)。提示嵌合质粒和非嵌合质粒免疫组用HBsAg刺激后均可产生明显的增殖反应，且前者的刺激指数高于后者；HBcAg刺激后嵌合质粒组产生了明显的增殖反应。表明这两种基因疫苗均可刺激产生有效的HBsAg特异性T细胞应答，且嵌合质粒免疫组的T细胞应答更强；嵌合质粒免疫组同时还产生了很强的HBcAg特异性T细胞应答。表2（略）
讨论
许多研究表明慢性HBV感染患者HBV特异性的CTL未能充分活化，因而通过细胞因子调节机制参与胞内病毒清除的作用较弱是乙型病毒性肝炎慢性化的重要原因［3,4］。很多研究表明针对核心蛋白的T细胞免疫应答是机体清除HBV感染的主要机制［5］。Kuhober等［6］研究发现单用HBcAg不能诱导细胞免疫应答，而用表达HBcAg的质粒免疫小鼠则可获得MHCI分子限制性的CTL应答，并认为这种特异性的CTL应答对慢性感染具有一定的治疗作用。Davis等将编码HBsAg的质粒免疫BALB/c小鼠和黑猩猩都获得了高滴度的抗HBs应答［7,8］。Mancini M和Prince AM等分别在转基因小鼠和慢性感染HBV的黑猩猩体内进行了评价有关乙型肝炎DNA疫苗的实验，结果显示具有良好的治疗应用前景［9，10］。ManciniBourgine M等用编码HBsAg的基因疫苗肌肉注射治疗慢性乙型病毒性肝炎，结果表明该基因疫苗可以明显降低体内HBV的滴度，促进机体清除病毒［11］。
目前的研究表明，DNA疫苗免疫剂量比传统疫苗要低得多。皮下与肌肉注射倾向于产生Th1类细胞因子和补体依赖性抗体，而基因枪接种于皮肤和肌肉则倾向于产生Th2类细胞因子和补体非依赖性抗［12］。可根据不同的目的选择使用不同的免疫接种途径，在本研究中为了在获得有效体液免疫应答的同时获得良好的细胞免疫应答反应，因而我们选择使用了肌肉注射的途径。另外所用免疫质粒的状态也是影响免疫效果的重要因素，本试验所用的质粒经琼脂糖凝胶电泳分析均以超螺旋形式存在。
通过对本研究所构建的嵌合质粒、非嵌合质粒及空载体对BALB/c小鼠分别进行了免疫，并检测了抗HBs、抗HBc水平和特异性淋巴细胞增殖活性。结果发现嵌合质粒、非嵌合质粒均可诱导机体产生明显的抗HBs应答，但嵌合质粒免疫组的HBsAb水平明显低于非嵌合质粒免疫组。可能是由于嵌合质粒表达的融合蛋白以非分泌形式存在，以致不能被抗原提呈细胞大量加工提呈，因而丧失了TI抗原的特性，也降低了HBsAg的免疫原性。另外也与基因疫苗的接种途径和嵌合基因在局部表达量的多少有一定的关系。嵌合质粒及非嵌合质粒组均未产生明显的抗HBc应答，证实HBc7883aa肽段确为HBcAg的主要B细胞表位［13］，该区段被替换后则不再诱导产生明显的抗HBc应答. 我们用HBsAg刺激后发现嵌合质粒和非嵌合质粒免疫组均可产生明显的增殖反应（P<0.01），且前者的刺激指数高于后者（P<0.05）。表明这两种基因疫苗均可刺激产生有效的T细胞应答，但嵌合质粒免疫组的T细胞应答更强，也证明了HBc颗粒作为病毒样颗粒载体可以增强对插入表位的T细胞应答。用HBcAg刺激后仅嵌合质粒组产生了明显的增殖反应（P<0.01），而非嵌合质粒组和空载体免疫组均无明显的增殖反应。这可能是因为嵌合质粒仍然保留了HBcAg的主要T细胞表位，而后两组没有对应的表位，因而不能活化HBcAg特异性的T淋巴细胞。
本研究表明该嵌合质粒免疫后可以诱导产生明显的抗HBs应答而未产生明显的抗HBc应答，同时获得了较强的HBcAg和HBsAg特异性的T细胞应答，因而有望成为一种新的治疗性基因疫苗。
参考文献
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7Davis HL, Michel ML, Whalen RG. et al. DNAbased immunization induces continuous secretion of hepatitis B surface antigen and high levels of circulating antibody. Hum Mol Genet. 1993， 2(11)∶1847-1851.
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9Mancini M, Hadchouel M, Davis HL, et al. DNAmediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996， 93(22)∶12496-12501.
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11ManciniBourgine M, Fontaine H, ScottAlgara D, et al. Induction or expansion of Tcell responses by a hepatitis B DNA vaccine administered to chronic HBV carriers. Hepatology. 2004，40(4):874-882.
12石辛甫.增强DNA疫苗效果的几种策略.微生物学免疫学进展, 2003，31(2)∶32-36.
13Bottcher B, Wynne SA, Crowther RA. Determination of the fold of the core protein of hepatitis B virus by electron cryomicroscopy. Nature. 1997， 386(6620)∶88-91.
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