【关键词】 γ-氨基丁酸； 肝星状细胞； 增殖； 胶原蛋白Ⅰ
The functional effect of gamma-aminobutyric acid on hepatic stellate cells XIAO Fan, ZHANG Yi, ZHANG Jian-ping, ZENG Hui, WEI Hong-shan.
【Key words】 Gamma-aminobutyric acid; Hepatic stellate cells; Proliferation; Collagen I
【First author's address】 Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China
Corresponding author: WEI Hong-shan, Email: littlechange@ 163.com γ-氨基丁酸（GABA）是一种人体抑制性神经传递物质，介导了中枢神经系统64%以上的抑制性神经信号[1]。肝功能障碍时，血中GABA含量增多，加重对中枢的抑制，引起肝性脑病[2]。肝性脑病为肝硬化最常见的病死原因, 是以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调的综合病症。肝纤维化是向肝硬化发展的初级阶段，目前认为该阶段是可逆的。因此，我们假设GABA与肝纤维化的发展有关，从而进一步引发肝硬化和肝性脑病。由于HSC的活化、增殖是肝纤维化发生的重要特征，因此本实验拟从GABA对HSC功能方面的影响来探讨GABA是否与肝纤维化的发生和发展有关。
一、材料与方法
1. 材料：碘化丙啶购自北京鼎国生物技术有限责任公司；RT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；胎牛血清和DMEM培养液购自美国Gibco公司。
2． HSCs的培养: 大鼠HSC-T6细胞株由本室保存，在含10%小牛血清的DMEM培养液中37℃、5% CO2条件下培养。
3. 流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡：实验分为对照组和实验组，每组3个样品。细胞培养24h后，更换新鲜培养液2.7ml，实验组中每孔各加入0.3ml GABA, 使样品终浓度为10-3mol/L。培养24h后收集1×106～5×106个/ml细胞。PBS洗涤，离心除去PBS, 加入冰预冷的70%的乙醇4℃固定1～2h。离心弃去固定液。用1ml碘化丙啶染液染色，4℃避光30min。流式细胞仪检测，S期细胞比率（SPF）＝S/(G0/1+S+G2M), 细胞增殖指数（PI）＝（S+G2M）/ (G0/1+S+G2M)。每组3个，共两组。
4. RT-PCR半定量分析HSCs胶原蛋白Ⅰ RNA合成: 经典Trizol方法抽提RNA，对RNA样品进行紫外分光光度分析定量。按照美国Invitrogen公司产品说明书逆转录合成cDNA。β-actin（227bp）引物为5′-AGCCATGTAC GTAGCCATCC-3′, 5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′; 胶原蛋白Ⅰ（634bp）引物为5′-GACTTCCTGGCT TCAAAGGC-3′, 5’-GACCCTCTCTTTCCTTCTTC-3′, PCR方法分别合成β-actin和胶原蛋白Ⅰ产物。扩增产物用凝胶成像系统进行定量分析，以β-actin为内对照，用胶原蛋白Ⅰ/β-actin的比值表示胶原蛋白Ⅰ的相对表达水平。
5. 统计分析：计数资料组间差异采用χ2检验分析，P<0.05时组间差异有统计学意义。
二、 结果
1. GABA对HSC增殖的影响：GABA浓度为10-3mol/L时，SPF为30.9%，明显低于对照组的41.84%（P<0.05）；PI为41%，明显低于对照组的52%（P<0.05）。
2. GABA对HSC细胞胶原蛋白Ⅰ RNA合成的影响：定量检测结果显示，GABA浓度为10-3mol/L时，HSC胶原蛋白Ⅰ RNA量为对照组的1.5倍。以β-actin为内对照用胶原蛋白Ⅰ/β-actin的比值表示胶原蛋白Ⅰ的相对表达水平，对照组和GABA组胶原蛋白Ⅰ相对表达水平分别为0.277和0.421（P<0.05），差异有统计学意义，见图1。
三、讨论
GABA作为中枢神经系统最主要的抑制性神经递质，不仅介导神经传导，还参与调节肝功能。有研究结果提示肝性脑病时中枢神经系统中GABA递质增加以及GABA神经元活动性增高是重要的原因之一。 Zhang等[3]发现增加GABA的活性可降低恶性肝细胞系甲胎蛋白mRNA的表达，可能抑制肝细胞癌的发生。Sun等[4]测定了恶性肿瘤细胞及其邻近正常细胞的膜电位，发现GABA活性的下调或失活可以导致恶性肿瘤细胞显著去极化。其他实验结果也表明GABA是肝细胞电位差和增殖活性的一个重要调节因素。GABA亦可阻止酒精对大鼠肝细胞的细胞毒性作用[5]。以上结果均显示GABA参与调节肝细胞的功能，介导多种肝脏疾病的发生和发展。
肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复的代偿反应。导致肝纤维化共同途径是HSC的激活,转化为肌成纤维细胞,合成大量的ECM。ECM尤其是胶原的过度沉积，形成纤维隔, 肝脏原有结构被破坏, 引发肝纤维化。因此HSC活化是肝纤维化发生的细胞学基础，是肝纤维化发生的中心环节[6]。近几年有研究显示交感神经系统神经递质刺激HSC增殖并表达胶原; 交感神经系统的阻断剂能减低实验性大鼠的纤维化程度[7]。HSC能表达神经内分泌标志性物质如: 神经营养因子、胶质纤维酸性蛋白, 并含有神经递质受体[8-10]。基于以上研究结果，我们假设GABA通过作用于HSC，参与肝纤维化的发生和发展。
结果显示，GABA浓度为10-3mol/L时，对细胞周期及细胞增殖活性影响明显。GABA组SPF为30.9%，明显低于对照组41.84%（P<0.05）; PI为41%，明显低于对照组（52%）。因此，GABA作用于HSC后，被阻止于G0/1期的细胞数明显增多,进入S期的减少,DNA合成减少,进一步影响下一个细胞周期。利用半定量RT-PCR方法分析胶原蛋白Ⅰ RNA合成，GABA浓度为10-3mol/L时，HSC细胞胶原蛋白Ⅰ的相对表达水平为对照组的1.5倍（P<0.05），差异有统计学意义。我们的研究结果表明，GABA能够调控细胞周期，并促进HSC分泌胶原。
总之，GABA可能是引起肝纤维化发生和发展的一个重要因素，其作用机制还需要进一步深入研究。
参 考 文 献
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