【关键词】 肝星状细胞；细胞周期；黏着斑激酶相关非激酶
FAK-related non-Kinase plasmid transfection inhibited hepatic stellate cell proliferation stimulated by fibronection HUO Xiao-xia, ZHANG Xiao-lan, SHEN Jian-gang, WEI Juan.
【Key words】 Hepatic stellate cell; Cell cycle; Focal adhesion kinase-related non-kinase
【First author's address】 Department of Gastroenterology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China
Corresponding author: ZHANG Xiao-lan, Email: xiaolanzh@ 126.com
黏着斑激酶相关非激酶（FRNK）是黏着斑激酶（FAK）的内源性抑制剂。我们应用细胞培养技术，以纤维连接蛋白（FN）刺激HSC增殖，在脂质体介导下瞬时转染FRNK质粒，探讨选择性阻断FAK磷酸化对HSC增殖及其细胞周期的影响，以期为逆转肝纤维化提供新的理论依据及治疗靶向。
一、材料与方法
1．主要试剂：FRNK表达质粒由美国Kenneth M Yamada博士惠赠；兔抗FAK、p-FAK（Tyr397）多克隆抗体分别购自美国Upstate公司、Santa Cruz公司；RNA提取试剂盒Trizol购自北京赛百盛基因有限公司；RT-PCR扩增系统购自美国Promega公司；活细胞计数试剂盒CCK-8购自日本株式会社同仁化学研究所。
2. 细胞株与细胞分组：肝星状细胞株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠赠，用含体积分数为8％胎牛血清的RPMI 1640培养液常规培养。细胞分组：对照组，FN组，脂质体组，空质粒组，FRNK质粒组；后4组中FN浓度均为50μg/ml。每组设6个复孔。
3. FRNK质粒瞬时转染：采用阳离子脂质体介导法进行细胞转染，按照Lipofectamine Reagent提供的实验手册操作。
4. 改良MTT法测定细胞增殖情况：于96孔培养板培养HSC，干预12、24、48h后每孔加入CCK-8试剂10μl，继续培养3h后在酶标仪450nm处读取吸光度（A）值。
5. 流式细胞仪测定细胞周期：将1×105 CFSC接种于6孔培养板中，FRNK质粒转染48h后收集各组细胞。75%冰乙醇溶液固定，4℃过夜，用含100mg/L RNA酶A的碘化丙啶染色，流式细胞仪检测细胞周期。
6．蛋白质提取液制备及Western blot：应用改良的RIPA裂解缓冲液裂解细胞，收集上清液，考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量。取适量蛋白质进行8%或10% SDS-PAGE分离，转膜，分别用抗FAK（1∶500稀释）、p-FAK（Tyr397）(1∶150稀释)、β-actin多克隆抗体(1∶300稀释)以及第二抗体（1∶3000稀释）与硝酸纤维素膜杂交。将膜置于化学发光试剂中1min，曝光、显影、定影。结果以目的蛋白质与β-actin的积分吸光度值的比值表示。
7. RT-PCR：采用Trizol试剂盒，按说明书一步法提取肝组织总RNA。引物序列：FAK上游引物为5′-ACTTG GACGCTGTATTGGAG-3′，下游引物为5′-CTGTTGCC TGTCTTCTGGAT-3′，扩增产物大小为833bp；β-actin上游引物为5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′，下游引物为5′-GTCACCCACACTGTGCCCATCT-3′，扩增产物大小为548bp。取2μg总RNA，采用50μl反应体系，同时扩增FAK和β-actin。应用Mulit Image凝胶图像分析仪进行吸光度扫描，结果以目的基因与β-actin积分吸光度值的比值表示。
8．统计学分析：实验数据用SPSS12.0软件进行方差分析及LSD检验。
二、结果
1．FRNK质粒瞬时转染CFSC效果鉴定：Western blot结果显示，在相对分子质量为4.2×104处出现FRNK杂交带，转染48h表达最强（3.16±0.09），72h后表达减弱（1.04±0.09），P<0.05，表明FRNK瞬时转染CFSC成功（图1略）。转染48h后，FRNK蛋白表达量在FN组较对照组明显升高（0.86±0.07对比0.33±0.09），P<0.01；在FRNK质粒转染组较FN组、脂质体组、空质粒组明显升高（2.63±0.09对比0.86±0.07，0.87±0.09，0.81±0.10），P<0.01，见图2（略）。可见FRNK在CFSC中能够独立表达；FN刺激后，其表达增加；FRNK基因转染后，外源性的FRNK在CFSC中大量表达。
2. FRNK对CFSC FAK转录和翻译水平的表达无影响：Western blot结果显示，FN组FAK蛋白表达量较对照组升高（2.98±0.17对比1.81± 0.07），P<0.01；但FN组、脂质体组、空质粒组与FRNK质粒转染组比较，差异无统计学意义（2.98±0.17，2.84±0.09，2.91±0.12对比 2.82±0.08），P>0.05。
RT-PCR结果显示，FN组FAK mRNA表达量较对照组增加（0.87±0.10对比0.43±0.06），P<0.01；但FN组、脂质体组、空质粒组与FRNK质粒组之间差异无统计学意义 (0.87±0.10，0.83±0.04，0.84±0.11与0.83±0.10)，P>0.05。
3．FRNK抑制p-FAK（Tyr397）蛋白表达：p-FAK（Tyr397）是FAK自身磷酸化并转变为活性状态的关键部位。Western blot结果显示，FN组p-FAK（Tyr397）蛋白表达量明显高于对照组（1.80±0.13对比1.10±0.11），P<0.01；但与脂质体组、空质粒组比较，差异无统计学意义，P>0.05；FRNK质粒转染CFSC 48h后，p-FAK（Tyr397）蛋白表达量较空质粒组显著降低（0.40±0.14对比1.89±0.25），P<0.01。
4．FRNK抑制CFSC增殖：改良MTT法证实，FN刺激细胞生长，与对照组相比，干预细胞12、24、48h后生长增殖率分别为12.44%，20.73%和22.94%，P<0.05；FN组与脂质体组、空质粒组比较，差异无统计学意义，P>0.05；FRNK质粒组与空质粒组相比，细胞增殖明显受到抑制，其增殖抑制率分别为20.07%，26.16%和29.77%，P<0.01。
5．FRNK阻滞CFSC细胞周期于G0/G1期：FRNK质粒转染48h后收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期，表明FN刺激可以加速CFSC细胞周期向S期转化，而FRNK质粒转染可使细胞周期停滞于G0/G1期（表1）。
表1 （略）
三、讨论
FAK作为一种非受体胞质酪氨酸蛋白激酶，磷酸化后对多种类型细胞的生物学行为具有重要影响，如促进增殖，正性调控细胞周期，增强黏附、迁移，调控凋亡等[1]。FRNK分子中缺乏FAK的N末端及激酶结构域，是内源性FAK抑制剂。对纤维肉瘤细胞及新生大鼠心室肌细胞的研究表明，FRNK过表达只是从功能上抑制FAK的磷酸化水平，p-FAK（Tyr397）表达下降，而总FAK含量无变化[2]。本研究结果显示，正常CFSC存在FRNK自主独立表达；将重组FRNK表达载体成功导入CFSC，发现FRNK过表达对转录与翻译水平的FAK含量无明显影响，但显著下调p-FAK(Tyr397)表达，与上述结论一致。在证实外源性FRNK可在CFSC内有效表达的基础上，进一步通过改良MTT法证实，FRNK转染12、24、48h后增殖抑制率依次增加，FRNK对CFSC增殖有显著抑制作用。
众多研究证实，FAK通过调控细胞周期促进多种细胞增殖，如FAK通过加速G1期进程，促进神经胶质瘤细胞增殖[3]；转染野生型FAK可促进内皮素诱导的星形胶质细胞的细胞周期转化[4]。相反，FAK反义寡核苷酸转染人肺动脉平滑肌细胞，可导致增殖抑制，G1期细胞数量明显增加[5]；小RNA干扰技术使FAK基因沉默，可阻滞神经胶质瘤细胞于G1期[3]。
本研究结果表明，FRNK质粒组CFSC大部分停留于G0/G1期，较FN组、脂质体组及空质粒组G0/G1期细胞数明显增多（P<0.01），证实FRNK质粒转染可封闭FAK功能，抑制CFSC增殖机制与阻滞细胞周期于G0/G1期有关。
参 考 文 献
[1]Zhang XL, Jiang HQ, Liu L, et al. Effects of Arg-Gly-Asp-Ser tetrapetide on integrin signaling and apoptosis in hepatic stellate cells. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2003,11:479-482.
张晓岚,姜慧卿,刘丽,等.精-甘-天冬-丝氨酸四肽对肝星状细胞整合素信号及凋亡的影响.中华肝脏病杂志，2003,11:479-482.
[2]Hanada M, Tanaka K, Matsumoto Y, et al. Focal adhesion kinase is activated in invading fibrosarcoma cells and regulates metastasis.Clin Exp Metastasis, 2005, 22: 485-494.
[3]Ding Q, Grammer JR, Nelson MA, et al. p27Kip1 and cyclin D1 are necessary for focal adhesion kinase regulation of cell cycle progression in glioblastoma cells propagated in vitro and in vivo in the scid mouse brain. J Biol Chem, 2005, 280: 6802-6815.
[4]Koyama Y, Yoshioka Y, Matsuda T, et al. Focal adhesion kinase is required for endothelin-induced cell cycle progression of cultured astrocytes. Glia, 2003, 43: 185-189.
[5]Lin CL, Zhang ZX, Xu YJ, et al. Focal adhesion kinase antisense oligodeoxynucleotides inhibit human pulmonary artery smooth muscle cells proliferation and promote human pulmonary artery smooth muscle cells apoptosis. Chin Med J (Engl), 2005, 118: 20-26.
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