姜黄素治疗肝纤维化及其作用机制的初步研究

【摘要】目的  观察姜黄素治疗肝纤维化的效果，初步探讨其作用机制。 方法  四氯化碳腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型，以丹参治疗作为阳性对照，检测血清ALT、AST、HA、LN、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、一氧化氮（NO）含量；检测肝组织超氧化物歧化酶（SOD）、羟脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）含量；肝组织行HE和Masson胶原染色，光镜下观察病理学改变，并按肝纤维化半定量计分系统进行评分。结果  与模型组比较，姜黄素治疗组能明显降低肝纤维化时异常升高的ALT、AST、NO、HA、LN、PCⅢ、MDA、Hyp，模型对照组分别为（693.75±117.57）U/L、（892.50±105.69）U/L、（70.95±10.23）μmol/L、（468.22±93.45）mg/L、（346.44±75.08）mg/L、（279.82±54.00）μg/L、（402.25±39.16）nmol/g、（752.50±77.62）μg/g, 姜黄素（每100g体重40mg）治疗组分别为（218.50±48.89）U/L、（376.60±79.13）U/L、（47.96±6.53）μmol/L、（289.96±60.43）mg/L、（107.35±27.24）mg/L、（148.95±28.63）μg/L、（236.10±30.54）nmol/g、（478.40±75.74）μg/g，P值均<0.05；提升肝纤维化时异常降低的肝组织SOD水平，姜黄素（每100g体重40mg）治疗组和对照组分别为（90.39±21.23）U/mg、（46.52±20.01）U/mg, P <0.05；明显改善四氯化碳所致大鼠肝纤维化的病理学改变, 肝纤维化评分明显降低（P<0.05），接近正常对照组，且该作用随着姜黄素剂量增大而加强。 结论  姜黄素具有治疗大鼠肝纤维化作用；抗脂质过氧化损伤、直接影响胶原代谢可能是其重要的作用机制。
【关键词】肝纤维化； 治疗； 姜黄素； 四氯化碳

Therapeutic effects of curcumin treatment on hepatic fibrosis   SHU Jian-chang*, YE Guo-rong, L  Xia, FANG Li, WU Hai-en, CHEN Xiao-juan. *Department of Gastroenterology, Affiliated Guangzhou Red Cross Hospital of the Medical College of Jinan University, Guangzhou 510220, China 
Email: shujc62@ hotmail.com
【Abstract】  Objective    To investigate the therapeutic effects and mechanisms of curcumin treatment on hepatic fibrosis.  Methods    A model of hepatic fibrosis was established using carbon tetrachloride intraperitoneal injections in rats. Curcumin was administered to one group of the model rats (curcumin group) and the other rats were used as controls (control group). Serum levels of ALT, AST, HA, LN, PCIII, and NO were measured, and Hyp, MDA, and SOD in liver tissues were measured. Liver tissue slides were stained with HE and Masson staining to study the pathological changes in the livers. Grades of hepatic fibrosis were evaluated according to a semiquantitative scoring system. Results    In the curcumin group, serum levels of ALT, AST, NO, HA, LN, PCIII, MDA, and Hyp, were (218.50±48.89) U/L, (376.60±79.13) U/L, (47.96±6.53)μmol/L, (289.96±60.43) mg/L, (107.35±27.24) mg/L, (148.95±28.63)μg/L, (236.10±30.54) nmol/g, (478.40±75.74)μg/g and all were lower than those of the control group (693.75±117.57) U/L, (892.50±105.69) U/L, (70.95±10.23)μmol/L,  (468.22±93.45) mg/L, (346.44±75.08) mg/L, (279.82±54.00)μg/L, (402.25±39.16) nmol/g, and (752.50±77.62)μg/g. The differences were significant (P <0.01). In the curcumin group, the level of SOD (90.39±21.23) in the liver tissues was significantly higher (P <0.01) than that of the control group (46.52±20.01). The hepatic fibrosis scores in the curcumin group were significantly lower than those of the control group, (P <0.01). These effects were dose-dependent. Conclusion    Curcumin reduces rat hepatic fibrosis. Anti-peroxidation and regulation of collagen metabolism in liver tissues may be involved in the therapeutic effectiveness of curcumin on hepatic fibrosis.
【Key words】Hepatic fibrosis;  Therapeutics;  Curcumin;  Carbon tetrachloride
肝纤维化是肝脏受到各种慢性损伤后发生的一种修复反应，以胶原为主的ECM在肝脏内过多沉积为其特征。其治疗除去除致病因素以外,抗纤维化治疗也很重要。本研究以四氯化碳诱导形成肝纤维化模型，以丹参治疗作为阳性对照，观察姜黄素治疗肝纤维化的效果，并初步探讨其可能的作用机制。
材料与方法
1. 主要药物和试剂：姜黄素购自国药集团化学试剂有限公司；丹参，产于四川，为人工栽培，水煎配制为1.0g/ml灌胃液；四氯化碳购自天津市北宏试剂厂；食用花生油；羧甲基纤维素钠购自广州器化医疗设备有限公司（进口分装）；ALT、AST检测试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司；HA、LN 、PCⅢ放射免疫分析试剂盒购自上海海岩医学生物技术中心；NO、SOD、MDA和Hyp试剂盒均购自南京建成生物研究所；苏木素、伊红购自美国Sigma公司；Masson三色胶原试剂盒购自福建迈新有限公司。
2. 实验动物和动物模型的建立：（1）SD大鼠：SPF级，雄性，体重为180～230g，由广州中医药大学实验动物中心提供[动物质量合格证号：SCXK（粤）2003-0001粤监证字2005A031]。于广东省药物研究所标准SPF实验室（合格证号：粤监证字2005C125号）进行动物饲养及实验。（2）肝纤维化模型的建立：腹腔注射CCl4 0.025ml (用花生油1∶6稀释)，每周3次，共14周。
3. 动物分组与治疗：动物随机分为正常对照组、溶剂对照组、姜黄素治疗组（按给药剂量的不同分为低、中、高剂量组）、模型对照组、丹参对照组。正常组不予处理；溶剂对照组前8周予腹腔注射花生油（每次0.15ml/只），每周3次，第9周起予0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，每次10ml/kg，每周3次，共6周；其余5组按上述方法进行造模；姜黄素治疗组从第9周起予姜黄素（剂量分别为每100g体重10、20、40mg）与0.5%羧甲基纤维素钠混悬后以10ml/kg灌胃，每周3次，共6周；模型对照组则自第9周起予0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，10ml/kg，3次/周，共6周；丹参对照组自第9周起予丹参（剂量为每100g体重 1g）10ml/kg灌胃，每周3次，共6周。
4. 观察项目: 于第8周结束后处死正常组及模型组各5只大鼠，进行血清及病理检测观察造模效果；14周动物实验结束后，采用股静脉放血法最大量取血，分离血清，-20℃保存待检；留取部分肝组织于10g/L中性甲醛液固定，部分于-170℃液氮中保存待检。
血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、NO检测均参照试剂盒说明书进行操作；肝组织匀浆检测MDA、SOD，新鲜肝组织碱水解法检测Hyp，参照试剂盒说明书进行；肝组织按常规方法行HE染色，参照试剂盒方法行Masson三色胶原染色，光镜下观察肝脏的病理改变。并按照肝纤维化半定量计分系统（SSS）方法，对各组大鼠肝纤维化程度评分，得分越高，表示纤维化程度越重；最高29分，最低0分[1]。
5．统计学处理： 数据采用x-±s表示，用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理，多组数据间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），进行方差齐性检验，若各组总体方差齐同，采用Tukey（n>5）检验；若各组总体方差不齐同，采用Tamhane’s  T2检验。
结    果
1. 造模效果：比较第8周末处死的正常对照组与模型组大鼠，模型组大鼠肝脏大体观色泽偏暗，表面欠光滑，体积未见明显变化，肝脏边缘变纯，质地较实，有结节感；血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ明显升高；病理切片观察有较多纤维生成，证实肝纤维化形成，造模成功。
2．肝功能指标及血清NO的变化：与正常对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST活性及NO含量明显升高（P<0.01）；姜黄素各组升高的ALT、AST、NO均有不同程度的降低（表1略）。
3. 血清肝纤维化指标的变化：与正常对照组比较，模型组血清中HA、LN、PCⅢ明显升高（P< 0.01）；低、中、高剂量姜黄素治疗组中上述指标呈不同程度下降，其中以中、高剂量组下降明显，差异具有统计学意义（表1略）。
4. 肝组织MDA、SOD及Hyp的变化：与正常对照组比较，模型对照组MDA、Hyp明显升高（P<0.01），SOD活性明显下降（P<0.01）；姜黄素可使MDA、Hyp不同程度地降低，SOD活性不同程度地升高（表2略）。
5. 肝组织病理变化：HE染色见正常对照组与溶剂对照组肝小叶结构完整，肝索排列整齐，无炎症细胞浸润；模型对照组肝小叶结构被破坏，肝索排列紊乱，有炎症细胞浸润，肝细胞水肿、脂肪变性明显，部分可见假小叶形成；高姜黄素组及丹参对照组可见汇管区有少量的纤维组织增生，未见假小叶形成，可见少量炎症细胞浸润，肝细胞水肿、脂肪变性明显减轻；低姜黄素组与模型对照组比较，无明显差异；中姜黄素组情况介于低、高姜黄素组之间（图1略）。
Masson三色胶原染色示：正常对照组与溶剂对照组仅在汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织增生，无假小叶形成；模型对照组见汇管区大量胶原纤维增生，增生的胶原纤维形成纤维分隔，破坏肝小叶结构，分割、包绕肝小叶，有假小叶形成；高姜黄素组及丹参治疗组胶原纤维明显减少，只见汇管区有较多的纤维组织增生，少部分亦见胶原向周边延伸，无假小叶存在；低姜黄素组与模型对照组比较，无明显差异；中姜黄素组情况介于低、高姜黄素组之间（图2略）。
综合HE及Masson染色的镜下表现，按照肝纤维化半定量评分方法，进行单盲读片并予以评分。各组得分结果见表3。结果显示：正常对照组、溶剂对照组得分差异无统计学意义；模型组肝纤维化评分明显升高（与正常对照组、溶剂对照组比较，P<0.01）；低姜黄素组得分与模型对照组比较，差异无统计学意义；中姜黄素组、高姜黄素组、丹参对照组得分呈不同程度降低，与模型对照组比较，差异均具有统计学意义（P<0.01）。
讨    论
姜黄素是从中药姜黄中提取的主要有效成分，有研究从体内、外观察证实姜黄素可抑制HSC增殖、活化，减少Ⅰ型胶原合成[2]。有学者认为姜黄素对HSC的抑制作用是通过诱导过氧化酶增殖活化受体γ基因表达并使受体活化而实现的[3]。其他学者观察到姜黄素可以改善四氯化碳所致的急、慢性肝损伤，并对其作用机制进行了初步探讨[4，5]，但鲜见有姜黄素治疗肝纤维化及其作用机制的报道。我们前期的工作证实：在细胞水平，姜黄素能明显抑制体外培养的大鼠HSC增殖，诱导其凋亡，有明确的时间、剂量相关性[6]，其作用机制与姜黄素使促凋亡基因Fas、p53表达增加，使抑制凋亡基因Bcl-2表达减少有关[7]；在大鼠活体水平，姜黄素具有确切的预防肝纤维化的作用[8]，其作用机制与姜黄素抑制HSC活化和增殖、诱导HSC凋亡有关[9]。我们在以往工作的基础上着重从大鼠活体水平观察姜黄素对纤维化的治疗作用，并初步探讨其作用机制。
本研究结果显示，姜黄素可显著降低肝纤维化时升高的ALT、AST、MDA，提高肝纤维化时异常降低的SOD活性，证实姜黄素具有改善肝功能的作用。肝纤维化时主要合成的ECM有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、LN等，其中以Ⅰ型、Ⅲ型胶原为主。LN是基底膜的主要成分，肝纤维化时明显增多，HA随着肝纤维化的加重或好转而升降，血窦内皮细胞功能低下时HA升高更为明显。PCⅢ为反映肝脏纤维增生的指标，其含量与肝纤维化程度呈正相关。Hyp为胶原蛋白所特有，肝纤维化时肝内增多的成分主要为胶原纤维，因此联合测定血清LN、HA、PCⅢ及肝组织Hyp含量，能较好地反映肝纤维化的程度。本研究中，我们发现姜黄素能明显降低肝纤维化时升高的血清LN、HA、PCⅢ及肝组织Hyp含量，随着剂量的增加，该作用不断增强，提示姜黄素有较好的治疗肝纤维化作用，且具有剂量相关性。
CCl4造模过程中，机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，如H2O2、O2-等，氧自由基攻击肝细胞膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，导致肝细胞损伤，而坏死肝细胞的膜成分、毒性代谢产物与炎症细胞的浸润都可激活Kupffer细胞释放出多种细胞因子，作用于静止状态的HSC并使其激活，活化的HSC产生大量的ECM，ECM的产生与降解失平衡，从而导致肝纤维化的形成。Novo等[10]研究发现，超氧阴离子作用于人HSC，可以使其坏死、迁移，使Ⅰ型前胶原产生增多。脂质过氧化作用产生了MDA等脂质过氧化物，因此，测定肝组织的MDA含量，可以反映肝纤维化时体内脂质过氧化的程度，间接地反映出肝细胞损伤的程度。SOD能清除造模产生的超氧阴离子自由基（O2-），从而保护肝细胞免受损伤，SOD活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。本研究中我们发现姜黄素能明显降低造模时升高的肝组织中的MDA水平，升高肝组织中的SOD水平，提示抗脂质过氧化、抗肝细胞损伤等作用可能是姜黄素治疗肝纤维化的重要机制。
NO是局部化学介质，是近年来逐渐被认识的气相信息分子，肝脏的各种细胞都具有生成NO的功能。它具有扩张血管、增加血管通透性、趋化作用、细胞毒等作用，从而导致组织损伤。李隽和曹治宸[11]认为在CCl4诱导肝纤维化形成的过程中，大鼠血清NO水平的增高可以进一步导致肝细胞炎症及损伤,NO在CCl4所致大鼠肝纤维化中具有氧化应激作用。在NO与HSC相互关系的研究中，Failli等[12]认为，NO可与其受体结合，使cGMP合成增加并发挥第二信使作用,如降低细胞内游离钙引起舒张，通过自分泌和旁分泌的方式来调节HSC的收缩。NO在HSC的活化、增殖及诱导凋亡等信号转导过程中作用如何，有待进一步研究。本研究中，姜黄素可显著降低造模时升高的NO，因而可能通过减少炎症介质、减轻氧化应激而发挥治疗纤维化作用。
本研究结果初步表明姜黄素具有治疗大鼠肝纤维化的作用，其作用机制可能与抗脂质过氧化、影响胶原代谢等有关。姜黄素具有不良反应少、作用广泛等特点，因此，临床应用前景广阔。姜黄素治疗肝纤维化作用其他方面的作用机制，特别是与HSC的关系如何，有待进一步深入探讨。
参  考  文  献
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