【摘要】目的 探讨TNFα对油酸诱导的脂肪变性肝细胞模型固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）的表达及TG含量的影响。 方法 以正常肝细胞株L02进行细胞培养，用油酸诱导建立肝细胞脂肪变性模型，在对照组（C组）及模型组（F组）中加入TNFα（C1组和F1组）与抗TNFα抗体（C2组和F2组）分组进行培养，采用RT-PCR法检测SCAP mRNA的表达，Western blot检测SCAP蛋白的表达，采用油红O染色观察细胞内脂滴的变化，并检测细胞内甘油三酯含量。结果 TNFα作用组SCAP mRNA的表达上调，C1组比C组上调67%，F1组比F组上调55%，F＝212.98，P<0.01，差异有统计学意义。TNFα作用组SCAP蛋白的表达也上调，C1组比C组上调45%，F1组比F组上调95%，F＝104.3，P<0.01，差异有统计学意义。而使用抗TNFα抗体作用后表达显著下调，细胞内TG含量, 对照组为（2.02±0.67）mg/107细胞，模型组为（7.79±1.35) mg/107细胞, 模型组＋TNFα组为（13.36±1.99）mg/107细胞, F＝82.94, P<0.01, TNFα作用组较对照组脂变细胞数量增多,差异有统计学意义，而使用抗TNFα抗体作用后脂变细胞数量减少，细胞内TG含量显著下降。 结论 TNFα上调L02肝细胞SCAP的表达，促进细胞内TG的合成，可能参与了肝细胞脂肪变性的形成。 【关键词】脂肪肝； 肿瘤坏死因子； 甘油三酯； 固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白 Effects of TNF alpha on the expression of SCAP and triglyceride contents in cultured steatotic hepatocytes YANG Lin-hui, CHEN Dong-feng. Department of Gastroenterology, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China Corresponding author: CHEN Dong-feng, Email: dfchen9@ hotmail.com 【Abstract】 Objective To explore the effects of TNF alpha on the expression of sterol regulatory element binding proteins cleavage activating protein (SCAP) and triglyceride contents in cells of a model of cultured steatotic hepatocytes. Methods A steatotic hepatocytes model was established by treating L-02 cell strain with oleic acid. The cells were treated with TNF alpha and/or TNF alpha antibody. The cells were divided into six groups: a control group (C), a model group (F), a control group with TNFα (C1), a control group with TNFα antibody (C2), a model group with TNFα(F1) and a model group with TNFα antibody (F2). The expression of SREBP-1c mRNA was measured with RT-PCR; the protein expression of SCAP was measured by Western blot; lipid droplets in the hepatocytes were observed with oil red O staining; the contents of triglyceride in hepatocytes were measured with an analytical kit. Results The mRNA expression of SCAP in the groups treated with TNF alpha were upregulated compared with those of the control group (C1 vs C increased 67%, F1 vs F inceased 55%, F = 212.98, P < 0.01), the protein expression of SCAP in the groups treated with TNF alpha was upregulated compared with those of the control group (C1 vs C increased 45%, F1 vs F increased 95%, F = 104.3, P < 0.01), and triglyceride contents in hepatocytes of these groups were increased compared with those of the control group [C (2.02±0.67) mg/107 cells, F(7.79±1.35) mg/107 cells, F1(13.36±1.99) mg/107 cells, F = 82.94, P < 0.01]. Conclusion TNF alpha upregulates the expression of SCAP and promotes the synthesis of triglyceride; it probably participates in the process of developing steatosis of hepatocytes. 【Key words】Fatty Liver; Tumor necrosis factor; Triglycerides; Sterol regulatory element binding proteins cleavage activating protein 固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（sterol regulatory element binding proteins cleavage activating protein，SCAP）定位于内质网膜，与膜结合转录因子固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBP）等调节因子共同控制一系列酶编码基因的转录过程。研究表明人类SCAP基因遗传变异将会导致血浆脂质代谢改变和组织中脂质代谢紊乱[1]，而脂代谢异常是NAFLD的基本环节之一。炎症因子TNFα是NAFLD的重要致病因素[2]，推测TNFα可能影响SCAP的表达而导致肝脏细胞脂质代谢紊乱，从而影响NAFLD的发生发展。本实验采用油酸诱导建立培养的肝细胞脂肪变性模型，并在此基础上探讨TNFα对肝细胞SCAP的表达及TG含量的影响。 材料与方法 1. 主要试剂：L02肝细胞株购自中国科学院上海细胞研究所，胎牛血清购自杭州四季青公司，TNFα及TNFα抗体购自北京奥博森公司，山羊抗人SCAP多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，RT-PCR试剂盒购自北京博大泰克公司，油红O购自美国Sigma公司，TG检测试剂盒购自南京建成生物研究所，Western blot试剂盒购自美国Pierce公司。 2. 肝细胞培养及分组：正常成人肝细胞株L02，用含10%胎牛血清的1640培养基传代培养，分为对照组和模型组，正常培养基培养的细胞为对照组（C组）、正常培养基加油酸诱导培养的细胞为模型组（F组）、C组+TNFα（C1组）、F组+TNFα（F1组）和C组+TNFα+抗TNFα抗体（C2组）、F组+TNFα+抗TNFα抗体（F2组）。TNFα与抗TNFα抗体浓度已由预实验确定，TNFα终浓度为200μg/L，抗TNFα抗体终浓度为20mg/L。 3. 培养肝细胞脂肪变性模型的建立：肝细胞培养于96孔板中,分别加入含不同浓度的油酸,用MTT比色法确定诱导细胞形成脂肪变性的最佳浓度。然后在正常培养基中添加该浓度的油酸培养72h，用油红O染色进行鉴定[3]。 4. 肝细胞内TG含量的测定：细胞种植于6孔培养板内，分为上述6组，每孔为1个样本，每组设6个样本，培养3d后收集细胞，反复冻融裂解细胞，3000r/min，离心10min，取上清液检测TG的含量，方法按试剂盒操作说明进行。 5. 培养肝细胞脂肪变性的组织学观察：细胞种植于6孔培养板内，分为前述6组，将1cm×1cm的玻片放入制作细胞爬片。培养3d取出，PBS漂洗，乙醇固定，采用油红O染色观察细胞内的脂滴并对脂肪变性细胞计数。结果判定标准：以细胞质内出现橘红色的脂滴为脂肪变性细胞。随机选取6个高倍视野，每个视野计数100个细胞，然后计算其平均脂变率。 6. 肝细胞SCAP mRNA的表达：细胞种植于6孔培养板内，分为前述6组，48h后终止培养。用冰预冷的PBS液冲洗培养孔3遍，加入美国Invotrigen公司的Trizol试剂1ml，吹打细胞，按Trizol说明书操作，提取细胞总RNA，电泳分析其完整性，测纯度，定量，-70℃保存。引物采用Primer design软件设计，由上海生工生物工程公司合成。SCAP：正义链：5′-GGCATCAAGTTCTACTCCATTC-3′，反义链：5′-AGCACAGAGGGCACATACAC-3′，扩增片段长度257bp；β-actin：正义链：5′-CGTGG ACATCCGCAAAGAC-3′，反义链：5′-CAAGAAA GGGTGTAACGCAACT-3′，扩增片段长度307bp，扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环。RT-PCR产物的鉴定和产量分析：扩增产物在同一张琼脂糖凝胶上进行电泳，电压100V，电泳30min，于GelDoc 2000凝胶图像分析系统进行扫描，用BandScan软件分析。测定产物条带的积分吸光度，以目的产物和内参照比值表示其相对含量。 7. 肝细胞SCAP蛋白表达：细胞种植于6孔培养板内，分为前述6组，72h终止培养。Western blot基本步骤如下：在培养肝细胞的6孔板中,每孔加入预冷RIPA缓冲液100μl，吸管吹打数次以充分裂解细胞，4℃ 15000r/min离心15min，取上清液并用Folin酚法测定蛋白浓度。各组取100μg细胞蛋白SDS-PAGE凝胶电泳。电泳采用80g/L的分离胶，50g/L的积层胶，待溴酚蓝全部电泳出分离胶底部，电转法将分离胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜（20V，17h）。膜用50g/L脱脂奶粉+10g/L BSA的1×TBS溶液封闭12h，再用第一抗体（SCAP 1∶500）4℃下孵育12h，第二抗体室温孵育60min。用发光试剂检测结合的辣根过氧化物酶标记的第二抗体，X线显影。 8. 统计学处理：实验所得计量资料用x-±s表示，采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。 结 果 1. 油红O染色显示培养肝细胞脂肪变性情况：对照组细胞边缘清晰,细胞内未见橘红色脂滴，模型组油酸诱导浓度为20mg/L, 诱导72h的肝细胞油红O染色见细胞内有大小不等的橘红色脂滴聚集(图1)，表明成功建立了肝细胞脂肪变性模型。 2. 肝细胞脂肪变性的程度：光镜下可见脂滴染为橘红色。对照组未见肝细胞脂肪变，细胞排列紧密，边缘清晰，核大。C1组可见少量细胞脂肪变，细胞中的脂滴较小。C2组几乎未见脂肪变细胞（图2）。F组可见大量脂肪变细胞（图1）, F1组脂变细胞最多，细胞内脂滴数量明显增多，部分融合成较大的脂滴（图3）。F2组与F1组比较脂肪变细胞明显减少（图4）。各组细胞脂肪变性率的比较: F2组与F1组比较（F＝57.68，P<0.01），差异有统计学意义，说明加入抗-TNFα(20mg/L), 脂变细胞数量减少。C1组与C组比较、F1与F组比较,差异有统计学意义（F＝57.68，P<0.01），但F1组增高更多，提示TNFα对C组及F组均有作用，但对F组作用更明显（表1）。 3. 肝细胞内TG含量的比较：各组肝细胞TG含量见表1。C1、F、 F1组较C组增高（F＝82.94，P<0.01）,其中F1组最高。C2组与C1组，F2组与F1组比较,差异有统计学意义（F＝82.94，P<0.01），说明加入抗-TNFα(20mg/L)后,TG含量降低。C2组与C组比较,差异无统计学意义（F＝82.94，P>0.05），20mg/L抗TNFα抗体完全拮抗了TNFα的作用。C1组与C组比较、F1组与F组比较差异有统计学意义（F＝82.94，P<0.01），但F1组增加更明显，表明TNFα对C组、F组均有作用，但对F组作用更明显。 4. TNFα对肝细胞SCAP mRNA表达的影响：各组肝细胞SCAP mRNA表达的比较: C1、F、 F1组较对照组增高（F＝212.98，P<0.01）, F1组增加最显著。C2组与C1，F2组与F1组比较，差异有统计学意义（F＝212.98，P<0.01），说明加入抗-TNFα(20mg/L)后,SCAP mRNA表达降低。C1组与C组比较、F1组与F组比较,差异有统计学意义（F＝212.98，P<0.01），但F1增强更明显，表明TNFα对C组及F组均有作用，但对F组作用更明显（图5，表1）。 5. 各组肝细胞SCAP蛋白表达的变化：各组均有SCAP蛋白的阳性表达， C1、F、 F1组较C组增高（F＝104.3，P<0.01）, F1组增加最明显。C2组与C1组，F2组与F1组比较,差异有统计学意义（F＝104.3，P<0.01），说明加入抗TNFα（20mg/L）后，SCAP表达降低。C1与C组比较、F1组与F组比较,差异有统计学意义（F＝104.3，P<0.01），但F1增强更明显，表明TNFα对C组及F组均有作用，但对F组作用更明显（图6，表1）。 讨 论 SCAP被认为是哺乳动物脂质合成和摄入的重要调节因子，在脂质代谢的平衡调节中起着非常重要的作用。SCAP定位于内质网膜，与SREBPs等调节因子共同控制一系列酶编码基因的转录过程。当细胞内胆固醇浓度降低时，SCAP激活SREBPs的两次蛋白酶解过程，从而释放有活性的转录因子片段。这些片段进入细胞核，激活维持细胞内脂质合成的相关的靶基因和LDL-R摄入脂质过程中所需的酶基因转录[4]。TNFα可促进肝细胞TG的合成及聚集[2]，是NAFLD的重要致病因素，但TNFα是否通过影响SCAP的表达而影响脂代谢目前不明确。 我们研究发现TNFα处理组SCAP mRNA及蛋白表达增强，与正常对照组比较有统计学意义，而用TNFα抗体处理后，SCAP mRNA及蛋白表达下降，说明TNFα可上调人肝细胞SCAP的表达。TNFα处理组TG含量增加，脂肪变细胞增多，用TNFα抗体作用后，TG含量减少，细胞脂肪变性减轻。以上结果表明TNFα上调SCAP表达的同时，促进了TG在肝细胞聚集，推测可能是SCAP的表达增强，激活了SREBP的裂解，进入核内的SREBP增多，从而激活其下游的TG合成酶、脂肪酸合成酶等系列靶基因转录，最终使肝细胞内TG合成大大增加，TG堆积导致脂肪变性。这表明SCAP本身可能参与了肝细胞脂肪变性过程，与肝细胞脂肪变性密切相关。 本实验还发现，TNFα虽然使SCAP的表达上调，但对正常肝细胞，只有少数细胞发生脂肪变性，而用于模型组时，发生脂肪变性的肝细胞大大增加，细胞内TG含量也显著增加。我们推测，当TNFα作用于正常肝细胞时，虽然SCAP表达增高使SREBP-1C增加，启动了脂质合成相关基因的表达，但由于细胞的自我调节平衡机制，细胞内脂质氧化基因表达可能代偿性增加，因而TNFα作用于正常肝细胞时，只有少数细胞发生脂肪变性。模型组肝细胞由于脂代谢失衡，对各种损害因子包括TNFα的敏感性增高[5],而且TNFα可诱导肝细胞线粒体UCP-2基因表达，后者可抑制线粒体内三磷酸腺苷的生成，导致线粒体能量代谢异常[6]；另一方面，由于FFA摄入增加，TG合成增多，使线粒体β氧化速度代偿性增加，为脂质过氧化提供了足够的反应基质，产生了具有反应活性和细胞毒性的活性氧簇，活性氧簇使细胞内抗氧化物质大量消耗，同时CYPⅡE高表达[7]，结果导致氧化与抗氧化失衡。这些因素使模型组脂肪变性细胞脂代谢紊乱进一步加重，因此TNFα作用于模型组肝细胞脂肪变性明显加重。 目前TNFα影响肝细胞脂质代谢失衡的机制尚不完全清楚。本实验发现TNFα可上调SCAP的表达，这与Ruan等[8]的报道一致。由于SCAP在脂代谢扮演着重要角色，因而TNFα导致的SCAP表达异常可能是肝细胞脂肪变性的重要机制。 参 考 文 献 [1]Yabe D, Xia ZP, Adams CM, et a1. 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