基因芯片主要有cDNA芯片和寡核苷酸（Oligo）芯片两种。我们已经对cDNA芯片用于病毒性肝炎联合诊断进行了研究［13］，而对于Oligo芯片，其探针的制备更为简化，直接通过分子生物学软件设计好探针序列后，人工合成相应的Oligo探针，调整浓度后，将其打印并固定在芯片上即可。本文研制乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)联合检测芯片，探讨其应用于临床检测的可能性。
材料与方法
一、实验材料
HBV全长质粒p3.8Ⅱ由基因工程研究所保存；HCV全长质粒pCVJ4L6S［4］由美国国立卫生研究院(NIH)的Jens Bukh博士馈赠；HBV、HCV阳性血清由广州军区广州总医院检验科、南方医院检验科提供；HBV、HCV Oligo探针由上海博亚生物技术有限公司合成。
二、Oligo芯片的制备
从GenBank数据库获取HBV全长DNA、HCV全长cDNA序列，根据病毒不同功能区分别进行BLAST分析，获得HBV、HCV种属保守序列，用生物学软件Array designer 3.0分别对种属保守序列逐一进行分析，设计长度均一的60mer Oligo探针。采用ABI公司3900基因合成仪合成上述Oligo。取下DNA合成柱，置1.2 ml新鲜的浓氨水中，65 ℃水浴2 h，使合成的Oligo从载体上切落并去除β腈乙基磷酸保护基。从合成柱上洗脱寡核苷酸片段，冰冻、干燥、去氨水，溶于9∶1甲酰胺和TBE中。上样于12%尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶上，电泳过夜，将目的条带割胶。经ddH2O浸泡过夜，以酒精沉淀、洗涤、真空抽干后，-20 ℃保存备用。一张芯片上打印6个阵列。阵列示意如图1所示。用PixSys 5500型基因芯片打印仪将探针打印在玻片上，每个探针3个重复点，点与点之间的距离为300 μm。用RDPCR技术进行样品标记［5-7］。
三、芯片杂交、清洗
将荧光标记样品与2×杂交液（50%甲酰胺，10×SSC，0.2% SDS）、Cot1 DNA（1 μg/μl）混匀；95 ℃变性5 min；迅速离心冷却。取适量样品点在探针阵列区域，小心盖上盖玻片，置入杂交盒，42 ℃杂交4 h。分别用洗脱液2×SSC、0.1％SDS洗5 min；0.1×SSC、0.1％SDS洗10 min；0.1×SSC洗1 min，重复4次。
四、芯片扫描分析
将芯片置于Agilent 2565BA基因芯片扫描仪中以激光能量90%，光电倍增管增益值(PMT)70%,分辨率5 μm进行扫描检测。用GenPix 6.0软件进行图像分析和荧光信号的采集。采用信噪比(SNR)值作为标准进行判断，信噪比低于4.0为阴性(-)，高于4.0为阳性(＋)。图1（略）
结果
一、获得HBV、HCV保守序列
将HBV、HCV基因组序列分别放入GenBank数据库进行BLAST分析后，得到HBV DNA的4个ORF：X、S、P、C区，HCV的5′非编码区（5′NT）、C、E1、NS5B区的若干区段适合60mer Oligo诊断特异性探针的设计。
二、探针设计
遵循设计的基本原则，运用Arraydesigner 3.0从HBV、HCV种属保守序列中分别挑选出12条60mer Oligo探针。Oligo探针的EMBL/DDBJ/PDB数据库检索结果说明我们设计的探针与其他生物体没有同源性或同源性很低。
三、HBV、HCV芯片杂交扫描结果
经GenePixpro 6.0分析其荧光强度值和背景值，并计算SNR。高特异性和高灵敏度寡核苷酸探针的判断标准为：SNR大于4.0，图2为样品病毒含量HBV、HCV分别为5.04×105、1.08×106 拷贝/ml的杂交扫描结果，从图中可见阳性对照及相应Oligo探针有明显杂交信号(SNR介于6.43～22.61之间)，空白和阴性对照无阳性信号检出（SNR小于4.0）。
四、临床血清标本检测应用
利用芯片法对小批量肝炎病毒阳性、阴性血清标本进行检测，其敏感性、特异性结果见表1。芯片法与检验科目前用于临床检测的real time PCR法进行比较，取得了较为一致的结果。图2（略）表1（略）
讨论
基因芯片技术与传统的基因诊断技术相比具有明显的优势，其突出的特点是集成化、微型化、自动化。
研究表明，增加探针的长度可提高灵敏度，50～70 mer的探针被认为同时具有较高的灵敏度和特异性，当探针长度超过70 mer时，探针内部容易形成较稳定的二级结构，从而妨碍了探针与靶序列的结合［8］。我们在实验中选择60 mer作为探针长度，可以区分的最少连续碱基错配个数为18，即当探针与目标基因的连续错配碱基个数低于18时，无法从杂交强度上将其进行区分，因而在探针的选择过程中除去了同源性大于70%的探针。
为确保探针的特异性需进行序列比对，序列比对是生物信息学的核心，比对的主要目的在于阐明序列之间的同源关系。我们先分别对HBV DNA或cDNA序列进行全长比对。根据比对结果剔除同源性高的区段，对同源性低的区段再行二次比对甚至三次比对，并选择再次比对结果中相似性分数值小于40的区段作为特异性序列。这样经生物信息学软件挑选出来的特异性序列和GenBank数据库系统中其他现有全部序列的同源性最低，可大大减少非特异性杂交，提高检测的精确度，同时也能有效地提高BLAST检索的效率。
本研究中设计的阳性对照polyU，由通用引物重复序列组成。样品经酶切、加接头、标记处理后带有与通用引物互补的接头序列，可与阳性对照探针杂交，用以监测样品标记及样品标记前的所有操作是否成功，检出因样品处理失败而造成的假阴性结果。在检测分析时，可以阳性对照的杂交信号作为内对照进行校正，即标准化处理。设计的2个阴性对照探针为水稻基因，经BLAST序列比对分析，其与肝炎病毒基因的同源性很低，不会出现非特异性杂交，以保证探针与样品的杂交特异性。利用芯片法对小批量肝炎病毒阳性、阴性血清标本进行检测，其敏感性和特异性分别为HBV 88.6%、94.0%；HCV 80.7%、92.5%，与用于临床检测的real time PCR法进行比较，取得了较为一致的结果。
总之，我们研制的肝炎病毒芯片诊断HBV、HCV的敏感性、特异性均较满意，为下一步集合更多种肝炎病毒的联合检测与分型打下基础，为检测芯片真正应用于临床做好准备，具有较为广阔的应用前景。
参考文献
1Sun Z H, Zheng W L, Zhang B, et al. Microarray for the detection of HBV and HDV. J Biochem Mol Biol. 2004，37∶546-551.
2孙朝晖,郑文岭,彭翼飞,等.应用限制性显示技术制备HCV cDNA诊断基因芯片的初步研究.微生物学报，2005,45∶226-229.
3孙朝晖,郑文岭,彭翼飞,等.丙型肝炎病毒1b亚型诊断芯片的制备与实验室研究.中华检验医学杂志，2005,28∶305-309.
4Yanagi M, Purcell RH, Emerson SU, et al. Hepatitis C virus: an infectious molecular clone of a second major genotype and lack of viability of intertypic 1a and 2a chimers. Virology，1999,262∶250-263.
5Sun ZH, Ma WL, Zhang B, et al. Application of restriction display PCR technique in the preparation of cDNA miroarray probes. WJG, 2005，11∶7579-7584.
6孙朝晖，郑文岭，彭翼飞，等. cDNA文库法在HCV-1检测芯片研制中的应用性研究.中国生物化学与分子生物学学报，2005,21∶415-420.
7孙朝晖，郑文岭，张宝，等. DNA芯片技术检测乙型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的初步研究.中华肝脏病杂志，2004,12∶563-564.
8Kane MD, Jatkoe TA, Stumpf CR, et al. Assessment of the sensitivity and specificity of oligonucleotide(50 mer) microarrays. Nucleic Acids Res，2000,28∶4552-4557.
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